不同耐藥性致病性副溶血性弧菌的生長特性比較研究

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(1. 上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 3. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛分布于溫熱帶地區的近海海水、海底沉積物和魚貝類等海產品中。該菌是一種人畜共患菌,它能引起水產動物疾病的發生,給水產養殖業帶來巨大損失[1],同時也是人類食源性疾病重要病原之一。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地區頻繁發生,以沿海城市為主[2]。它是亞洲許多國家引起食源性腸胃炎的主要病原菌[3]。我國食源性疾病監測資料顯示[4 - 5],副溶血性弧菌食物中毒居細菌性食源性致病之首。抗生素通常被認為是治療此類疾病的良好藥劑,但隨著抗生素的大量使用該菌的耐藥性不斷增加[6]。

1996年,美國食品及藥品管理局(FDA),疾病預防和控制中心(CDC)和美國農業部(USDA)建立了國家耐抗菌素監測系統(NARMS)。表明微生物耐藥性是一個日趨嚴重的問題。世界衛生組織(WHO)在2011年4月7日的世界健康日中強調微生物耐藥性的重要性[7],呼吁積極采取措施應對微生物耐藥性。我國是世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一,耐藥菌引起的醫院感染人數已占住院感染總人數的30%左右。然而,各相關部門對食源性病原微生物抗菌藥耐藥風險評估研究工作基本上沒有開展[8]。

因此,本研究的主要目的是,通過不同溫度下不同耐藥性致病副溶血性弧菌生長特性的比較,為食品安全風險評估提供數據支持。同時,對這些菌株進行ERIC - PCR分子分型,從基因型角度分析其變異性,另外,一級生長模型的建立,為以后的耐藥性副溶血性弧菌的風險管理提供依據。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯,TCBS培養基,Luria - Bertani營養肉湯,Luria - Bertani營養瓊脂 均購于北京陸橋技術有限責任公司;Mueller Hinton Agar(MHA) 英國OXOID。

抗生素:阿莫西林 - 克拉維酸(Amoxicillin - clavulanic acid)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢他啶(Ceftazidime)阿米卡星(Amikacin)、慶大霉素(Gentamicin)、四環素(Tetracycline)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氯霉素(Chloramphenicol),復方新諾明(Trimethoprim -Sulfamethoxazole) 均由英國OXOID公司生產。

MLS - 3750型高壓滅菌鍋 三洋電機生物醫藥株式會社;SW - CJ - 1FD 系列超凈工作臺 上海新苗醫療器械制造有限公司;GHP - 9270 型隔水式恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;Bioscreen FP - 1100C型全自動微生物生長曲線分析儀 芬蘭,Oy Growth Curves Ab Ltd公司。

1. 2 菌株的獲得

菌種:實驗用的副溶血性弧菌菌株信息見表1,并經過PCR檢測其致病基因tdh,trh(方法參照GB/T4789. 7 - 2008,FDA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9)。獲得的8株含有tdh基因的菌株用25%的甘油管保存,一份置于- 20℃冰箱保存待用,一份置于 - 80℃冰箱保存。

1. 3 藥敏實驗

菌株活化:將副溶血性弧菌菌株從 - 20℃保存的甘油管中經活化后劃線至TCBS平板,37℃培養18 ～24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3%NaCl,pH8. 0)中,放入搖床中,37℃,150r/min,培養18h,同時,三株質控菌EscherichiacoliATCC25922、StaphylococcusaureusATCC25923和PseudomonasaeruginosaATCC27853經活化后劃線至LBA平板,37℃培養,挑去單菌落至LB中搖床培養18h。

藥敏實驗:按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)規定[9],K - B紙片擴散法對分離的副溶血性弧菌菌株耐藥性進行測定。首先將菌液調至濁度為1. 5×108cfu/mL(OD值約為0. 13),用棉拭子蘸取一定量的菌液均勻涂布到約4mm厚度的MHA平板上,待干后,將帶有特定濃度的藥敏紙片貼于平板上。置于37℃恒溫培養箱中培養18h測量抑菌圈的直徑。副溶血性弧菌的敏感性判定標準見表2。

1. 4 生長參數的獲得

1. 4. 1 生長曲線測定 將副溶血性弧菌菌株從- 20℃保存的甘油管中活化后,劃線至TCBS平板,37℃培養18 ～ 24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3% NaCl,pH8. 0)中,放入搖床中,37℃,150r/min,培養18h,菌株生長到達指數后期(109CFU/mL),以此為初始接種液。

采樣梯度稀釋法:在Bioscreen配套的100微孔板中進行梯度稀釋。吸取初始接種液20μL接種至第一孔180μL TSB中,以此為第一稀釋梯度。用移液器吹吸混勻后,再從這個孔中吸取20μL接種至第二孔180mL TSB中,依次梯度稀釋到第5孔(104CFU/mL)TSB中,按相同方式做兩個平行,將加好菌液的100孔板放入Bioscreen的樣品槽中,Bioscreen的設置為每30min讀取一次,中速震蕩,吸光度為420 ～ 580nm的寬波段,培養溫度分別為20,25,37℃,分別測定這三個溫度下的生長曲線,每組實驗重復兩次。

生長曲線擬合分析采用OriginPro 8軟件,生長參數數據比較采用SPSS17. 0軟件進行單因素方差分析。

表2 藥敏紙片的中英文名稱及劑量Table 2 Chinese name and English name of antibiotic disk and its dose

表3 8株菌株的耐藥結果Table 3 Results of antibiotic resistant of 8 strains

注:R表示耐藥;S表示敏感;I表示中介。

1. 4. 2 應用微生物預測模型 采用修正的Gomperz growth model(1)[10],用OriginPro8軟件擬合方程如下

y=α0+(α - α0)×exp( - exp(1+μmax×2. 72×((λ - t)/(α - α0))))

(1)

初始OD值為α0=0. 12為104菌量時的OD值。α代表最大的生長的OD值,λ代表延滯期(h),μmax表示最大比生長速率(h-1)

1. 5 ERIC - PCR 比較菌株的差異性

ERIC - PCR擴增引物[11]Eric1:5′ - TAAGCTCC TGGGATTCAC - 3′、Eric2:5′ - AAGTAAGTGACTGGGG TGAGCG - 3′,由上海生物工程有限公司合成;PCR體系為:12. 5μL的TaKaRa公司的Mix,引物(10μmol/L)各1μL、200ng DNA模板,用經滅菌的去雙蒸水補齊25μL。ERIC - PCR擴增條件:預變性 95℃ 7min、變性 94℃ 1min、退火52℃ 1min、延伸65℃ 8min、總延伸65℃ 16min、10℃保存、30個循環。使用1. 5%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳,緩沖液為1×TAE,以120V恒壓電泳,電泳約60min后使用溴化乙錠染色15min后進行成像觀察并保存。

ERIC - PCR圖譜分析以分子量大小相同的條帶作為相同性狀,陽性結果記為1,陰性結果記為0,使用Gel - pro 4. 5軟件分析,將輸出的結果以Dice為系數采用非加權平均法(UPGMA)利用SLT - Ntsy -2. 10e軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 8株致病性副溶血性弧菌的耐藥性分析

采用K - B紙片擴散法,從8株含tdh基因的致病性副溶血性弧菌中檢出6株耐藥菌株Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16,Vp 17,Vp 18。其中Vp 8耐慶大霉素,Vp 5、Vp 14、Vp 17均只耐阿米卡星,Vp 16耐阿米卡星和慶大霉素,Vp 18菌株耐阿米卡星,環丙沙星,和左氧氟沙星。圖1為Vp 2對AMC、AK、CTX的藥敏實驗結果,具體結果見表3。

圖1 Vp2對AMC、AK、CTX的藥敏實驗結果Fig. 1 Results of antibiotic resistant test of Vp2 to AMC、AK、CTX

2. 2 8株致病性副溶血性弧菌的生長特性比較分析

表4 8株副溶血性弧菌用modified Gompertz模型擬合的生長參數擬合結果Table 4 Fit of growth parameters for 8 V. parahaemolyticus strains by modified Gompertz model

通過Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀測定這8株菌生長過程的比濁度,用修正的Gompertz擬合測定的數據。

修正的Gompertz模型擬合結果R2均在0. 98以上,MSE均小于等于0. 003,可知修正的Gompertz模型適合擬合本實驗結果。

由表4及圖2修正的Gompertz的擬合結果可知,20℃時Vp 18菌株的生長最快,方差分析可知,與Vp5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05)與Vp 16,Vp 17,Vp 21不存在顯著性差異(p>0. 05),Vp 17次之,僅與Vp 2存在顯著性差異,Vp5生長最慢,但其僅與Vp 18有顯著性差異;8株菌的延滯期無顯著性差異(p>0. 05);Vp2的最大生長量最大,但與Vp5沒有顯著性差異(p>0. 05),與其他的菌株都有顯著性差異(p<0. 05)。Vp18的最大生長量最小,與Vp2和Vp5有顯著性差異(p<0. 05),與其他的菌株均無顯著性差異(p>0. 05)。

25℃時Vp 18菌株生長最快,與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05),與Vp16,Vp17,Vp21不存在顯著性差異(p>0. 05),Vp 17次之,除了與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2有顯著性差異外,與其他菌株均無顯著性差異,而Vp 2最慢,與Vp 18,Vp17,Vp16,Vp21存在顯著性差異;Vp 5的延滯期最短,只與Vp 2有顯著性差異(p<0. 05),而Vp 2的延滯期最長,與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16有顯著性差異,而與其他幾株菌無顯著差異(p>0. 05);Vp2的最大生長量最大,與其他菌株均有顯著性差異(p<0. 05),Vp 8的最大生長量最少,與其他菌株無顯著性差異(p>0. 05)。

37℃時8株菌的最大比生長速率無顯著性差異(p>0. 05);Vp 2的延滯期最長,且與其他的菌株有顯著性差異(p<0. 05),而其他幾株菌間無顯著性差異(p>0. 05);Vp 2的最大生長量最大,與Vp 8和Vp 18存在顯著性差異(p<0. 05),與其余菌株均無顯著性差異(p>0. 05),Vp 18的最大生長量最少,與Vp 2和Vp 21存在顯著性差異(p<0. 05),與其余菌株均無顯著性差異(p>0. 05)。

綜上,不同耐藥致病副溶血性弧菌菌株的生長參數存在一定的差異性,但是菌株的各個生長參數的大小與菌株的耐藥性的程度之間沒有明顯的對應關系。且發現一株三重耐藥性菌株Vp 18與另外一株敏感性副溶血性弧菌Vp 5在20℃和25℃下的最大比生長速率有顯著差異,其他菌株無顯著差異。

圖2 8株副溶血性弧菌生長曲線及其用modified Gompertz模型擬合結果Fig. 2 The growth curves and fitting curves of 8 V. parahaemolyticus strains by modified Gompertz model

2. 3 8株致病性副溶血性弧菌的ERIC - PCR 圖譜分析

由圖3,條帶的條數及位置獲得的聚類分析圖譜可知,耐藥性菌株Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16有100%的相似性。此4株菌株與非耐藥性菌株Vp 21有89%的相似性,耐藥菌株Vp 18與非耐性菌株Vp 2有89%的相似性。在相似系數0. 86處,此八株菌株可以分為兩大類,Vp5,Vp 8,Vp 14,Vp 16與Vp21和 Vp17歸為一類,Vp 18與V p2為一類。ERIC - PCR 是一種有效的細菌基因分型方法,能夠精確確定菌株間的親緣關系[12],為菌株的差異性比較提供了基因型信息。ERIC - PCR圖譜與菌株的耐藥性沒有明顯的對應性。

圖3 8株菌的ERIC圖譜及擴增條帶的UPGMA系統發育樹聚類分析Fig. 3 UPGMA dendrogram illustrated the clustering of amplification patterns of the 8 V. parahaemolyticus isolates with ERIC - PCR

3 結論

本文比較了耐藥性致病副溶血性弧菌與非耐藥性致病副溶血性弧菌的生長差異。并用修正的Gomperz growth model擬合了此8株耐藥性菌株與非耐藥性菌株在20、25、37℃下,在TSB(含3%NaCl)中的生長曲線。

在37℃適宜溫度下,八株菌的最大比生長速率無顯著性差異(p>0. 05),而在20℃和25℃條件下,Vp 18生長最快與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05)。與Lianou[13 - 14]等報道的結果一致,說明溫度會影響副溶血性弧菌的μmax間的差異,差異性隨著溫度的降低而增高。

三重耐藥的致病副溶血性弧菌Vp 18的生長明顯優于非耐藥性菌株Vp 2,說明耐藥性與菌株的生長快慢有一定的聯系,可能由于菌株的生長速率快,產生變異性的可能性大,獲得耐藥性的概率也隨之增大。菌株之間的微生物生長動力學參數的變異性將會對風險評估的準確性帶來影響[15],此結果可為耐藥性副溶血性弧菌的風險評估提供數據支持。

耐藥性致病副溶血性弧菌Vp 18與非耐藥性致病性副溶血性弧菌Vp 2的ERIC - PCR圖譜歸為一類,表明這兩株菌的亞型相似,也說明耐藥性基因可能來自質粒上,這也為副溶血性弧菌的耐藥機制的研究提供了一定的參考。

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