微生物胞內油脂染色法檢測技術進展

,, ,

(1. 唐山學院 環境與化學工程系,河北唐山 063000;2. 衡水市質量技術監督檢驗所,河北衡水 053000)

微生物油脂又稱單細胞油脂,是從產油微生物(酵母、霉菌、細菌和藻類等)中獲取的一種新型脂質。由微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳氫化合物為碳源,在菌體內產生的大量油脂。微生物油脂經轉酯化可制備生物柴油,而且微生物油脂中富含各種多不飽和脂肪酸、色素等[1 - 2],可以緩解目前自然資源嚴重短缺和油脂需求量增大的矛盾。隨著微生物發酵技術的發展和推廣,高產油脂微生物的篩選和發酵過程中油脂含量的監控逐漸成為國內外研究的熱點之一。采用一種快速、簡單的單細胞油脂檢測方法,可大大提高菌種篩選和發酵研究工作的效率。

目前,常用的油脂含量測定方法有:油脂抽提稱重法:如索氏抽提法、有機溶劑法、酸水解法、超臨界CO2萃取法等,此類方法需要大量的樣品經過細胞破碎處理,溶劑消耗量大,操作繁瑣耗時耗力,不適合大批量的篩選研究和實時測定;染色法:如蘇丹染色法、尼羅紅染色法、磷酸香草醛顯色法等。染色法比油脂抽提稱重法更簡單,樣品需求量少,且節約大量的時間。因此油脂染色檢測技術是一種快速、簡單的油脂測定方法,可提高科研和生產中油脂測定效率,縮短工作時間,為產油微生物的高通量篩選奠定基礎;同時也避免提取油脂對溶劑、時間和人力的耗費,對推動產油微生物的研究有著實際意義[3]。本文對微生物胞內油脂的特性及近年來胞內油脂染色檢測技術等方面的進展進行了綜述,以期為微生物油脂定性及定量檢測的發展和應用提供參考。

1 微生物油脂特性及不飽和脂肪酸合成途徑

在酵母、霉菌等真核微生物中,某些產油種屬能積累占其生物總量70%以上的油脂,其中以甘油酯(Triacylglycerol,TAG)為主,約占80%以上,磷脂約占10%以上。TAG的主要功能普遍認為是作為碳源和能源的儲備化合物,另外它具有比碳水化合物和蛋白質高的熱值,一經氧化將產生很高的能量。另外還具有維持膜結構完整和正常功能的作用[4]。微生物油脂主要是由多不飽和脂肪酸(簡稱PUFAs)組成的甘油三酯[5]。多不飽和脂肪酸是指含有兩個或兩個以上碳 - 碳雙鍵的脂肪酸,主要包括亞油酸(LA)、γ - 亞麻酸(GLA)、α - 亞麻酸(ALA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等。微生物油脂脂肪酸組成和一般植物油基本相同,其烴類大部分為偶數碳,棕櫚酸、油酸、亞油酸的含量很高,但有些微生物油脂中多不飽和脂肪酸(PUFAs)含量特別高。酵母和霉菌生產各種類胡蘿卜素、甾醇、脂?；拾贝碱惿窠浨手疤侵?支鏈脂肪酸和羥基脂肪酸一般出現在細菌脂質中,微藻脂質中一般有高比例的多不飽和脂肪酸。酵母的脂肪酸組成一般與植物油脂相似,其中油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸占多數;霉菌中脂肪酸種類比酵母多,真菌油脂在成分上類似于植物油[6]。

微生物產生油脂的過程,本質上與動植物產油脂過程相似,都從乙酰CoA羧化酶催化羧化反應開始,后經過多次鏈的延長,或再經去飽和作用等完成整個生化過程。在此過程中,有兩個主要的催化酶,乙酰CoA羧化酶和去飽和酶。其中乙酰CoA羧化酶催化脂肪酸合成的第一步。去飽和酶是微生物通過氧化去飽和途徑生成不飽和酸的關鍵酶,這一過程稱之為脂肪酸氧化循環。微生物體內不飽和脂肪酸的生物合成途徑見圖1。

圖1 動物體內和微生物體內不飽和脂肪酸(PUFAs)的生物合成途徑[6]Fig. 1 The biosynthetic pathways of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)for animals and microorganism[6]

2 蘇丹染色檢測技術

蘇丹染色技術是指利用蘇丹染料對細胞染色后檢測胞內油脂含量的技術。蘇丹染色法常用染料有蘇丹黑B、蘇丹Ⅲ和蘇丹Ⅳ。蘇丹黑B為偶氮染料,具有脂溶性,可溶于無水酒精,但不溶于水(常用70%酒精飽和液),當菌株入染液時,蘇丹黑B便離開染液而溶于組織內的脂質(如脂滴中)使組織內脂類著色[7]。蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ為紅色染料,在脂肪中的溶解度比在酒精中的溶解度大。當用蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ的酒精溶液處理含有脂肪的生物組織時,酒精中的蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ進入脂肪中使其著色[8]。

目前通過蘇丹染色檢測油脂技術主要集中于兩方面:一方面用于產油脂菌株的定性觀察,多數研究者用于產油脂菌株的初篩。菌株經蘇丹黑染色后,菌體內脂肪粒呈藍黑色,根據脂肪粒的大小、多少可初步判斷油脂含量。選擇菌體油脂顆粒多的菌株進行下一步復篩。鄭紅波等[9]利用蘇丹黑染色技術從土樣中初篩得到47株具有產油脂能力的菌株,他們發現菌株經過蘇丹黑染色后菌體內油脂顆粒被染成黑色,可依據黑色油脂顆粒的大小,油脂顆粒的多少初步篩選產油脂能力強的菌株。馬麗娟等[10]利用細胞化學方法蘇丹Ⅲ染色法對4株高產油脂菌株進行初篩,得到一株細胞內含有較多脂滴的菌株。他們對兩株酵母菌和兩株霉菌染色,經二甲苯洗脫,沙黃復染后,顯微鏡下觀察菌絲體成粉紅色,油脂顆粒呈亮黃色。宋安東等[11]從微觀方面,先用蘇丹黑染色,顯微鏡下觀察脂肪粒數目和大小,發現細胞和菌絲呈紅色,菌體內的脂肪顆粒呈藍黑色;后用蘇丹Ⅲ菌泥染色法觀察菌體顏色,他們發現對含油脂菌體在蘇丹Ⅲ染色時,發現顏色的變化與菌體含油量之間有較好的相關性并呈現一定的規律,低脂菌體顏色偏紅,高脂菌體顏色偏灰。Ines Schulze等[12]將從土壤中篩選出的酵母菌體影印到濾紙,將吸附了菌體的濾紙經過干燥,0. 08%的蘇丹黑染色,用96%的乙醇兩次沖洗后,觀察顏色,濾紙被染成藍色的位置相對應的菌體可能為產油脂菌株,此方法可一次性處理多個樣品,節省了篩選菌體時間。Liu等人[13]從森林土樣得到的61株真菌、酵母和細菌，利用蘇丹黑染色,后鏡檢觀察胞內脂滴篩選出16株產油脂真菌。Varavut Tanamool等[14]同時利用蘇丹黑和尼羅藍染色法觀察Hydrogenophagasp. 菌株在蔗糖培養基中連續培養積累PHA(聚羥基脂肪酸酯)的情況。

另一方面用于產油脂菌株的定量分析。蘇丹黑B可有效地與細胞中的油脂成分結合并對某一波長的光具有吸收峰值。通過建立細胞經蘇丹黑B染色后的吸光值與對應的油脂含量的關系,得出相應的線性回歸方程,則可由測出的樣品液吸光值,通過回歸方程計算樣品的油脂含量。董欣榮等[15]利用蘇丹黑染色法定量測定土生假絲酵母菌體內油脂標準曲線。林汝榕等[16]建立了微藻油脂含量與吸光值A645的線性回歸方程,最終可由測出的樣品液吸光值,通過回歸方程計算樣品的油脂含量。為今后快速定量檢測微生物油脂含量提供依據。

3 尼羅紅染色檢測技術

尼羅紅染色檢測技術是指利用尼羅紅染料染色后檢測細胞內油脂含量的技術。尼羅紅(Nile Red,NR)是一種親脂性的熒光染料,可用于微生物、細菌、酵母、浮游植物等細胞中脂類的定性和定量分析[17]。尼羅紅最早是用于產油藻種的篩選[18]。大量研究表明,尼羅紅能與脂類物質,包括蠟脂和三酰甘油及游離脂肪酸結合發出很強熒光[19],在543nm的激發光照射下,顯示波長為598nm的桔紅色熒光,在450 ～ 500nm的激發光照射下,顯示波長大于528nm的金黃色熒光[20]。尼羅紅能夠準確地將細胞內脂類物質與其他貯藏物區分開來,因此經常被用于檢測動物以及微生物細胞內油脂情況。林義等[21]通過在添加尼羅紅的培養基中培養酵母,并觀察菌落熒光的方法對385株深海酵母進行產油脂菌株篩選,建立了一套尼羅紅染色快速測定油脂含量的方法。尼羅紅可以對細胞中的油脂進行定量分析,細胞經染色后的相對熒光強度與細胞內油脂含量顯著相關[22]。梁文艷等[23]以尼羅紅為熒光探針,對小球藻油脂含量的定量分析條件進行了研究,發現當熒光激發光波長為485nm,發射光波長為580nm時,適用于測定微藻中的中性油脂含量。當藻液光密度OD680在0. 61至1. 73時,油脂含量與尼羅紅熒光測定值呈現良好的線性關系,可以通過尼羅紅熒光值的測定推算油脂的含量。此外,某些種屬的微藻由于細胞壁較厚、較堅硬,尼羅紅不易滲入,染色效果不是很理想。因此,王海英等[24]對尼羅紅熒光染色測定脂質的方法進行了改進,采用20%二甲基亞砜溶液作為滲透劑,加強尼羅紅與胞內脂質的結合,同時他們采用尼羅紅丙酮溶液染色有效的提高了熒光發射強度。王金娜等[25]利用尼羅紅染色法對微藻進行篩選,并利用該方法對微藻中性脂的積累過程進行了跟蹤,結合透射電鏡觀察脂肪體,使中性脂的積累過程更加形象、直觀。

也有研究表明,尼羅紅作為脂類熒光探針,與細胞中中性油脂反應后,在激發光波長450 ～ 500nm,發射光波長大于528nm時,在熒光顯微鏡下可觀測到金黃色熒光,而極性脂與尼羅紅反應后,在激發光波長515 ～ 560nm,發射光波長大于590nm時,觀測到的是紅色熒光[26]。利用這點可以通過選擇激發光波長來區分中性脂和極性脂[27]。Guodong Feng等[28]同時利用尼羅紅(NR)熒光光譜法和傅里葉變換紅外光譜法(FT - IR)兩種方法測定6種微藻細胞中的油脂含量,并且利用尼羅紅熒光染色法定位油脂在微藻中存在的位置。使尼羅紅染色方法能夠較為準確地反映胞內脂質的性質和含量,并可作為自然界中廣泛篩選富脂微藻的一種快速檢測方法。

4 磷酸香草醛顯色檢測技術

磷酸香草醛顯色檢測技術是指利用磷酸香草醛間接與脂類物質反應顯色檢測細胞內油脂含量的技術。磷酸香草醛顯色法常用于藥物和血液中脂質的檢測[29 - 30]。不飽和脂類與硫酸作用水解后生成碳鎓離子,試劑中的磷酸與香草醛的羥基作用產生芳香族的磷酸酯,并且改變了香草醛分子中的電子分配。使醛基變成反應增強的酯基,碳鎓離子與磷酸酯的羰基起反應,生成紅色醌化物,吸收可見光[31]。根據顏色的深淺即可以定性分析油脂含量的高低,同時該物質在530nm存在最大光吸收,且與菌體油脂含量成正相關,通過測定其在530nm的光吸收即可定量分析油脂含量[32]。經過發酵產脂的酵母經處理后進行磷酸香草醛反應,會生成一種有色物質,其反應體系的顏色從淺綠色到茶紅色,隨油脂含量的增加而加深[33]。宋安東等[34]將初篩后的經過產脂培養的菌體經過磷酸香草醛反應后,反應顏色有明顯變化,根據其顏色深淺判斷其含油率高低。并且驗證其在530nm處的吸光值與氯仿甲醇抽提法測得的菌體油脂含量成正比。胡元維等[3]通過對磷酸香草醛顯色法測定條件優化,建立了快速、準確測定微生物胞內油脂的方法,并將該方法應用在真菌(裂殖壺菌)和微藻(隱甲藻)兩種菌的單細胞油脂含量的測定上,經過稱重法與磷酸香草醛顯色法比較,進一步證實優化的磷酸香草醛顯色法分析結果可快速、準確地測定菌體內油脂的含量。

此外,磷酸香草醛顯色法不用再單獨進行細胞的破碎步驟,該方法中的硫酸對細胞壁可直接作用。Jacques Izard等[35]建立了一種快速利用磷酸香草醛顯色法篩選產油脂的工程突變菌株,并對細菌細胞內的脂質進行定量測定的方法。在研究中他們驗證了此方法可不用任何提取步驟就可快速準確的定量細胞內油脂。另外,Zongdi Hao[36]等通過稱重法與磷酸香草醛顯色法比較,發現對微藻內中性油脂的定量測定中磷酸香草醛與重量法的吸光度(在530nm)線性關系良好(R2=0. 9038),并利用此方法從七種微藻中篩選出一種高產油脂(占25. 52%干重)的微藻(Monoraphidium pusillum)。在對高產油脂酵母突變菌株的選育中Jufang Wang等[37]直接利用磷酸香草醛顯色反應定量油脂含量。通過驗證,其結果與甲醇 - 氯仿抽提法得到的結果有較好的一致性,兩種方法的平均誤差為2%,最大誤差為5. 2%。為產油微生物的高通量篩選和油脂含量測定提供了一種實際可行的方法。

5 展望

目前采用蘇丹染色法檢測油脂主要集中在油脂的定性和定量檢測。其定性檢測在對產油脂菌株的快速初篩中占據著重要地位,通過簡單快速的細胞染色就可觀察細胞產脂情況,可在短時間內處理大量樣品;其定量檢測方法只要得到少量培養好的菌體,即可用蘇丹黑染色法確定吸光度,再從標準曲線估算油脂濃度,方便快捷,不需要通過物理或化學方法破碎細胞壁和進行常規的溶劑抽提。只要確定了吸光度和油脂濃度的標準曲線、就能很快地得出結果。用該方法預測菌體的含油量,能夠及時決定取舍,避免了后序工作中許多不必要的勞動,也節省了時間[15]。蘇丹黑染色檢測方法儀器要求簡單、價格低廉,可實現對工業化油脂生產過程動態性監測。但蘇丹黑染色法很容易由于脫色不好而影響觀察,并且對于霉菌,很容易由于孢子的存在,影響染色和觀察。并且如果進行大量產油真菌的初篩,工作量會很大[38]。因此,蘇丹黑染色法適合用于大量樣品的初篩工作,且較適合對產油酵母和微藻菌株進行定量分析。

尼羅紅染色法主要集中在定量檢測油脂,其利用與油脂作用后熒光強度進行定量分析。與蘇丹黑染料比較,尼羅紅能夠準確的將細胞內脂類物質與其他儲藏物區分開來[39],且靈敏度高、可動態觀察細胞內油脂積累情況。但如果檢測過程中存在紅色、淺紅色等菌體顏色較深的酵母則會干擾到熒光觀察進而無法做出準確判斷[21]。若用熒光分光光度計對尼羅紅染色后的微藻脂含量測定只能相對定量,如要對油脂尤其是中性油脂進行絕對定量,則要進行微藻油脂含量(主要用稱重法)與染色后相對熒光強度之間的標定[40]。并且尼羅紅對藻類油脂的定量測定受到藻種的影響,并不是所有藻類都適用于尼羅紅熒光定量分析[41]。綠藻由于細胞壁較厚,尼羅紅不易與細胞內油脂發生反應,有時難于測定。因此,尼羅紅染色法比較適合對細胞壁較薄的菌體進行油脂定量檢測。

磷酸香草醛顯色法也主要集中在定量分析,其利用硫酸 - 磷酸香草醛試劑與生物體反應,生成的紅色物質在可見光區的吸光值進行定量測定。其儀器要求簡單、價格比較便宜,操作中更簡單、精確,且樣品需要少,可節約大量時間。但利用磷酸香草醛顯色法也存在不足之處:硫酸和細胞中非油脂組分(蛋白、色素等)反應產生一定的顏色干擾,致使菌體和純油脂測得數據出入較大;溶劑、顯色劑質量濃度和添加量對吸光度影響顯著,因此會對結果產生一定誤差[3]。雖然上述三種方法都可用在產油脂菌株的定量檢測中,但均不能做到絕對定量,需要其他方法進行標定。

在我國利用微生物生產油脂具有原料來源豐富、可再生、成本低、周期短、環境友好、不受季節、氣候變化的限制等優點,已引起人們的高度重視。開展微生物油脂的研究對解決人類面臨的資源短缺、環境惡化、人類健康等現實問題具有重要意義。因此采用一種快速、簡單的細胞油脂檢測方法,可大大提高菌種篩選、發酵研究、工業化生產等工作的效率。

為此,筆者認為微生物油脂染色檢測方法的研究可從以下兩方面來進一步展開:

開展將三種染色技術適用于何種種屬進行實驗研究,對比三種染色技術在不同種屬間的優缺點;開展繪制三種染色方法對相同菌屬的不同菌株進行定性分析的標準曲線,可分別針對酵母、真菌和微藻建立一套完整詳實的染色法檢測機制。將油脂染色法快速定量檢測油脂含量技術應用于更多的產油微生物菌株的選育及工業生產的實時監控中,可進一步擴大微生物油脂的應用領域。

[1]Ratledge. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production[J]. Biochimie,2004,86(11):807 - 815.

[2]Miao X,Wu Q. Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil[J]. Bioresour Technol,2006,97(6):841 - 846.

[3]胡元維,任路靜,孫冠男,等. 基于微孔板比色法的微生物胞內油脂快速檢測方法的建立及應用[J]. 中國油脂,2013,38(7):89 - 94.

[4]劉波,孫艷,劉永紅,等. 產油微生物油脂生物合成與代謝調控研究進展[J]. 微生物學報,2005,45(1):153 - 155.

[5]高媛,李元媛,王常高,等. 高產油脂酵母的篩選及發酵條件的研究[J]. 化學與生物工程,2010,27(1):55 - 58.

[6]何東平,陳濤. 微生物油脂學[M]. 北京:化學工業出版社,2006.

[7]相光明. 產油脂酵母菌株的篩選[D]. 泰安:山東農業大學,2009.

[8]王秀莉,姜鵬,董春光. 生物組織中脂肪鑒定方法的探索與比較[J]. 生物學通報,2012,47(11):48 - 49.

[9]鄭紅波,劉光華,李昕然,等. 產油脂微生物菌種的篩選、鑒定及其油脂組成分析[J]. 四川大學學報：自然科學版,2010,47(6):1397 - 1401.

[10]馬麗娟,邢大輝,王紅蕾,等. 培養條件對產油微生物生長的影響[J]. 生物工程學報,2009,1(25):55 - 59.

[11]宋安東,馮沖,王風芹,等. 生物油脂高產菌株篩選方法研究[J]. 微生物學通報,2009,36(3):383 - 388.

[12]Ines S,Silla H S G. Characterization of newly isolated oleaginous yeasts - Cryptococcus podzolicus,Trichosporon porosum and Pichia segobiensis[J]. AMB Express 2014,4:24.

[13]Liu G Q,Lin Q L,Jin X C,etal. Screening and fermentation optimization of microbial lipid - producing molds from forest soils[J]. African Journal of Microbiology Research Vol,2010,4(14):1462 - 1468.

[14]Varavut T,Tsuyoshi I,Paiboon D,etal. Biosynthesis of Polyhydroxyalkanoate(PHA)by Hydrogenophaga sp. Isolated from Soil Environment during Batch Fermentation[J]. Journal of Life Sciences,2011,5:1003 - 1012.

[15]董欣榮,曹健,趙斌,等. 幾種真菌油脂的檢測與提取[J].鄭州工程學院學報,2002,23(1):14 - 18.

[16]林汝榕,邢炳鵬,蔡文旋,等. 蘇丹黑染色處理細胞技術在快速檢測微藻油脂含量中的應用[J]. 臺灣海峽,2011,30(2):292 - 298.

[17]Bertozzini E,Galluzzi L,Penna A,etal. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red[J]. Journal of Microbiol Methods,2011,87(1):17 - 23.

[18]Wilkie A C,Edmundson S J,Duncan J G. Indigenous algae for local bioresource production:Phycoprospecting[J]. Energy for Sustainable Development,2011,15(4):365 - 371.

[19]Diaz G,Melis M,Batetta B,etal. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio[J]. Micron,2008,39(7):819 - 824.

[20]Greenspan P,Fowler S D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe,nile red[J]. Journal of Lipid Research,1985,26:781 - 789.

[21]林義,鐘添華,駱祝華,等. 尼羅紅染色法篩選產油酵母及定量檢測胞內油脂含量的研究[J]. 微生物學通報,2012,39(1):125 - 137.

[22]胡小文,馬帥,弓淑芬,等. 熒光光譜法檢測微藻中油脂[J]. 中國油脂,2011,36(4):70 - 74.

[23]梁文艷,張元春,曹敬燦,等. 采用尼羅紅熒光探針對微藻中油脂的定量測定[J]. 環境化學,2013,32(8):1491 - 1495.

[24]王海英,符茹,黃寶祥. 基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質快速檢測方法研究[J]. 中國油脂,2012,37(3):78 - 81.

[25]王金娜,嚴小軍,周成旭,等. 產油微藻的篩選及中性脂動態積累過程的檢測[J]. 生物物理學報,2010,26(6):472 - 480.

[26]Liu Z Y,Wang G C,Zhou B C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris[J]. Bioresource Technology,2008,99:4717 - 4722.

[27]Elsey D,Jameson D,Raleigh B,etal. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids[J]. Journal of Microbiological Methods,2007,68:639 - 642.

[28]Feng G D,Zhang F,Cheng L H,etal. Evaluation of FT - IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination[J]. Bioresource Technology,2013,128:107 - 112.

[29]韓素琴,劉養清,任榮芳. 香蘭素熒光法測定黃芪口服液中的黃芪甲甙[J]. 山西農業大學學報,2002,22(1):75 - 77.

[30]Frings C S,Fendley T W,Dunn R T,etal. Improved determination of total serum lipids by the sulfo - phospho - vanillin reaction[J]. Clinical Chemistry,1972,18(7):673 - 674.

[31]Tietz N W. Fundamentals of Clinical Chemistry[M]. Philadelphia:WB. Saunders Company,1982,76 - 79.

[32]李仁民,王菊芳,馬爽,等. 利用脂肪酸合成酶抑制劑和磷酸香草醛反應篩選高產油脂酵母菌[J]. 微生物學通報,2008,35(4):545 - 549.

[33]Izard J,Limberger R J. Rapid screening methods for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells[J]. Journal Microbiological Methods,2003,55(2):411 - 418.

[34]宋安東,劉玉博,謝慧,等. 利用轉座標簽mTn - 1acZ/leu2插入突變發酵性絲孢酵母2. 1368 - Leu-篩選高效產油突變株[J]. 生物工程學報,2011,27(3):468 - 474.

[35]Jacques I,Ronald J. Limberger. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells[J]. Journal of Microbiological Methods 2003,55:411 - 418.

[36]Hao Z D,Liu P H,Yang X,etal. Screening method for lipid- content microalgae based on sulfo - phospho - vanillin reaction[J]. Advanced Materials Research,2013,610 - 613:3532 - 3535.

[37]Wang J F,Li R M,Lu D,etal. A quick isolation method for mutants with high lipid yield in oleaginous yeast[J]. World J Microbiol Biotechnol,2009,25:921 - 925.

[38]秦艷紅,葉德贊. 海洋產油真菌的簡便初篩[J]. 臺灣海峽,2010,29(1):128 - 133.

[39]Kranz R G,Gabbert K K,Madigan M T. Positive selection systems for discovery of novel polyester biosynthesis genes based on fatty acid detoxmcation[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997,63(8):3010 - 3013.

[40]石玉新,穆迪,武洪慶,等. 微藻油脂含量的幾種快速測定方法[J]. 安徽農業科學,2012,40(21):11067 - 11069.

[41]Chen W,Zhang C,Song L,etal. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae[J]. Journal of Microbiological Methods,2009,77:41 - 47.