丹參對(duì)暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝損傷及肝再生的影響*

朱 琥 朱清靜

武漢市醫(yī)療救治中心(湖北 武漢，430023)

數(shù)年前我們報(bào)導(dǎo)了丹黃方具有促進(jìn)大鼠肝再生的作用，在本文中我們將進(jìn)一步觀察丹參對(duì)FHF 大鼠肝損傷的影響及其促進(jìn)行肝細(xì)胞再生的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF 級(jí)Wistar 大鼠，體重(220.4 ±20.8)g，雌雄各半，購(gòu)自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。硫代乙酰胺(TAA):上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)為20030324。PCNA 試劑盒(武漢博士德公司產(chǎn)品)。丹參注射液為丹參水煎醇沉濃縮成每ml 含生藥1g 的提取液，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)提供。PHGF 購(gòu)自上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20030701。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取Wistar 大鼠113 只，體重(180～230)g，雌雄兼用，隨機(jī)分為4 組:正常對(duì)照組8 只，F(xiàn)HF 組35 只，丹參組30 只，PHGF 組30 只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，F(xiàn)HF、丹參組和PHGF 組動(dòng)物模型采用TAA 皮下注射，劑量按每kg 體重600mg，2 次，間隔24h，復(fù)制FHF 動(dòng)物模型。丹參組和PHGF 組動(dòng)物除皮下注射TAA 外，于實(shí)驗(yàn)前3 天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別于皮下注射丹參注射液1ml/100g 和PHGF 1ml/100g，F(xiàn)HF 組大鼠同時(shí)皮下注射生理鹽水1ml/100g 。FHF 組、丹參組和PHGF 組，于第2 次注射TAA 后24h，隨機(jī)取大鼠各8 只，麻醉后腹主動(dòng)脈取血測(cè)肝功能。隨后迅速取肝左中葉組織，用10%甲醛液固定，制成石蠟切片，備檢。其余大鼠用于36h病死率觀察。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 肝功能 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及總膽紅素(TBil)含量，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.3.2 肝細(xì)胞MI 普通病理切片常規(guī)染色后，計(jì)數(shù)1 000 個(gè)肝細(xì)胞中有絲分裂肝細(xì)胞數(shù)目，換成百分比。

1.3.3 肝細(xì)胞PCNA 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加10%正常羊血清封閉，順序加一抗、二抗、三抗，繼之以PBS 沖洗，以聯(lián)苯二氧胺(DBA)顯色，甲基綠復(fù)染。胞核顯示棕褐色為PCNA 陽(yáng)性。PCNA 標(biāo)記指數(shù)以隨機(jī)選擇高倍視野中至少1 000 個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)的PCNA 陽(yáng)性核的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示 (陽(yáng)性核數(shù)目/計(jì)數(shù)的肝細(xì)胞總數(shù)×100%)。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物病死率的情況 FHF 組36h 病死率67.5 %(25/37)，丹參組和PHGF 組36h 病死率分別為36.3 % (8/22)、40.9 % (9/22)，與模型組比較差異具有顯著性意義(P ＜0.05)。

2.2 各組動(dòng)物的肝功能情況 見(jiàn)表1。從表1 可知，丹參具用一定的降低ALT、AST 和TBil 的作用，與FHF 組比較有顯著性差異，但與PHGF 組比較，無(wú)顯著性差異。

表1 各組動(dòng)物的肝功能情況比較(±s)

表1 各組動(dòng)物的肝功能情況比較(±s)

與正常組比較，○P ＜0.05，* P ＜0.01;與FHF 組比較，▲P ＜0.05△P ＜0.01

2.3 肝再生指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。從表2 可知，丹參具有顯著提高肝細(xì)胞MI 和PCNA 的作用，與FHF 組比較差異有顯著性意義(P ＜0.01)，但與PHGF 組比較，差異無(wú)顯著性意義。

表2 各組動(dòng)物肝細(xì)胞MI 和PCNA 結(jié)果(±s)

表2 各組動(dòng)物肝細(xì)胞MI 和PCNA 結(jié)果(±s)

與正常組比較，* P ＜0.01;與FHF 組比較，△P ＜0.01

3 討論

正常情況下，肝細(xì)胞增殖極少，然而肝損傷后，尤其是肝切除后，肝臟表現(xiàn)出驚人的增殖能力，但對(duì)FHF 時(shí)肝再生的變化存在著不同看法。Saunder 曾認(rèn)為FHF 的發(fā)生與FHF缺乏肝再生有關(guān)，改善患者存活率在于用肝細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子刺激肝再生，促進(jìn)肝功能恢復(fù)［1］。然而許多實(shí)驗(yàn)研究表明，肝細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子只能提高非致死量藥物引起的肝損傷、肝衰竭動(dòng)物的存活率，對(duì)于致死量藥物引起的嚴(yán)重肝損傷，治療無(wú)效［2］。Wolf 用PCNA 免疫組化方法，比較FHF、急性肝炎肝再生的變化，指出了FHF 殘留肝細(xì)胞似乎達(dá)到或接近最大增殖能力，對(duì)于FHF 處理在于減少肝細(xì)胞壞死而不是刺激肝細(xì)胞再生［3］。PCNA 是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核內(nèi)酸性蛋白質(zhì)，其分子量在33～36KD 之間，由261 個(gè)氨基酸組成。PCNA 存在并合成于核內(nèi)，靜止細(xì)胞中PCNA 含量很少，增殖細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中其含量發(fā)生明顯變化，大部分G0～G1 期細(xì)胞無(wú)明顯的PCNA 表達(dá)，G1 晚期其表達(dá)度增加，S 期達(dá)到高峰，G2～M 期下降，其含量和表達(dá)強(qiáng)弱的變化與DNA 合成及DNA 復(fù)制的活躍程度一致。因此，PCNA 是評(píng)價(jià)肝臟再生的一個(gè)指標(biāo)。

藥理學(xué)研究表明，丹參有改善微循環(huán)、增加毛細(xì)血管網(wǎng)、擴(kuò)張血管、抑制凝血、激活纖溶等作用。李焰等［4］探討FHF時(shí)丹參對(duì)腸系膜微循環(huán)的作用，結(jié)果丹參治療組動(dòng)物血漿內(nèi)毒素水平為(013274 ±0.10752)Eu/ml，明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，同時(shí)腸系膜微循環(huán)灌流得到顯著改善，結(jié)果表明丹參治療FHF 可能與降低血漿內(nèi)毒素水平、改善微循環(huán)有關(guān)。張志偉等［5］采用大鼠部分肝缺血后肝部分切除模型，研究了術(shù)后第1、3、7d 殘肝肝再生度、肝細(xì)胞MI、血清甲胎蛋白(AFP)陽(yáng)性率、血清ALT 和白蛋白(Alb)的變化，以及動(dòng)物10d 存活率。結(jié)果顯示:丹參組大鼠ALT 和Alb 術(shù)后第7d恢復(fù)到正常水平，10d 存活率為66.7% (缺血組為25%，P ＜0.05)，術(shù)后第3 天AFP 陽(yáng)性率為85.7% (缺血組為33.3%，P ＜0.05)，與缺血組比較，術(shù)后殘肝再生度和肝細(xì)胞MI 增加。結(jié)果表明，丹參對(duì)缺血?dú)埜卧偕忻黠@促進(jìn)作用。王俊萍等［6］研究認(rèn)為，丹參具有促進(jìn)肝臟再生的作用，可部分逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷肝臟DNA 合成和再生能力的抑制作用。

我們前期研究結(jié)果表明丹黃方明顯促進(jìn)肝再生大鼠HGF mRNA、Tec mRNA、c-fos mRNA 及PC3 mRNA 的表達(dá)，與模型組比較，差異有顯著性意義(P ＜0.01);丹黃方可上調(diào)LRF-1 mRNA 的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1mRNA 的表達(dá)，與模型組比較，但差異無(wú)顯著性意義(P ＞0.05)。丹黃方具有促進(jìn)大鼠肝再生的作用［7～9］。

本實(shí)驗(yàn)中，PCNA 在正常組肝細(xì)胞中表達(dá)較弱，在模型組中表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明模型組肝細(xì)胞處于G1 及S 期的比例增多，細(xì)胞增殖旺盛，在丹參組和PHGF 組PCNA 表達(dá)強(qiáng)于模型組，說(shuō)明中藥丹參有促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。

［1］Saunder SJ，Macdonald R，Terblenche J.The treatment of actue liver failure.In:Popper H，Schaffner Feds.Progress in liver disease.vol4［M］.New York:Grune GL Stratton，1972:33340.

［2］Fujiwara K，Ogata I，Tomiya T，et al.Insulin and glucogen therapy of acute hepatic failure ［J］.Dig Dis Sci，1991，36 (6):8093.

［3］Wolf HK，Michalopoulos GK.Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitia:a study of proliferation cell nucier antigen expression ［J］.Hepatology，1992，15:707.

［4］李焰，郜玉珍，吳筱芳，等.丹參對(duì)暴發(fā)性肝衰竭腸系膜微循環(huán)改善作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，1998，15(1):9.

［5］張志偉，吳在德.丹參對(duì)大鼠肝缺血后殘肝再生促進(jìn)作用的初步觀察［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，24 (4):272.

［6］王俊萍，王思元.酒精對(duì)大鼠殘肝再生的影響及丹參的保護(hù)作用［J］.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，10 (5):102 -103.

［7］朱清靜.丹黃方對(duì)大鼠肝再生過(guò)程中PC3、c-fos、LRF-1 影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18 (1):32-34，37.

［8］朱清靜，陳鋒，盛國(guó)光.丹黃方對(duì)部分肝葉切除大鼠肝組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2008，16(3):168 -171.

［9］朱清靜，陳鋒，盛國(guó)光.丹黃方對(duì)部分肝葉切除大鼠肝組織中TEC 影響［J］.臨床肝膽病雜志，2009，(1):41 -43.