姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF表達的影響

袁琦 張征 胡小宣

湖南省人民醫院肝病內科，湖南長沙 410005

姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF表達的影響

袁琦 張征 胡小宣

湖南省人民醫院肝病內科，湖南長沙 410005

目的研究姜黃素體外對人結腸癌Lovo細胞血管內皮生長因子VEGF表達的影響。方法不同濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)姜黃素處理2013年8月—2014年2月中南大學提供的人結腸癌細胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR檢測姜黃素對人結腸癌細胞株血管內皮生長因子VEGF mRNA表達的變化，用Western blot法檢測姜黃素對人結腸癌細胞株VEGF蛋白表達的變化。 結果人結腸癌Lovo細胞經過姜黃素處理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黃素組VEGF mRNA及蛋白的表達均明顯下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 姜黃素能下調人結腸癌Lovo細胞VEGF的表達，并呈劑量依賴，這可能是姜黃素抑制結腸癌Lovo細胞增殖及侵襲性的機制之一。

姜黃素；結腸癌；血管內皮生長因子

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用，且毒性低，具有良好的臨床應用潛力，尤其是其抗腫瘤作用受到國內外廣泛關注。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來以手術、化療、放療、免疫等的綜合治療手段取得了一定的進展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制著化療藥物和免疫制劑等的應用和療效。有研究表明，姜黃素能顯著抑制結腸癌HCT-116細胞的生長[1]，姜黃素能顯著抑制人結腸癌Lovo細胞的增殖并促進其凋亡[2]，研究證實在腫瘤的侵襲、轉移過程中，血管內皮生長因子（VEGF）起到了極其重要的作用[3]。該實驗以2013年8月—2014年2月中南大學提供的結腸癌Lovo細胞作為研究對象，觀察了不同濃度姜黃素對結腸癌Lovo細胞VEGF表達的影響，以求從多角度對姜黃素對結腸癌細胞的作用進行研究，對結腸癌臨床治療提供有益的理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結腸癌Lovo細胞由中南大學腫瘤研究所提供；姜黃素購自Sigma公司，稱取3.684 mg的原料藥充分溶解于1 mL DMSO中，得到終濃度為10 mmol/L的母液，臨用時用完全細胞培養液稀釋到所需濃度。Trizol、逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司，引物由大連寶生物公司合成。蛋白提取液及ECL發光試劑盒購自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗體及羊抗兔二抗lgG購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞的培養及處理

人結腸癌Lovo細胞接種于含10%胎牛血清1640培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至對數生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的Lovo細胞，實驗分組為對照組（姜黃素0 μmol/L，加入等量DMSO），姜黃素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L組，處理后再置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養24 h。

1.3 Real-time PCR

采用Trizo1試劑一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，計算OD260/280，比值在1.8～2.0的RNA標本用于反轉錄。總RNA按說明書進行逆轉錄反應合成cDNA，逆轉錄產物cDNA用于Real-time-PCR擴增。VEGF引物：5'端: 5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端:5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，變性、退火溫度為94℃與72℃，40個循環。利用標準曲線，根據樣品CT值計算出樣品中所含的模板量。

1.4 Western Blot

用蛋白提取液提取細胞蛋白，BCA測總蛋白質濃度。蛋白樣品用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，上樣量為20 μg。5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，4℃過夜，加兔抗人VEGF多克隆抗體(1：500)室溫2 h，洗膜30 min，加入羊抗兔二抗(1：1000)室溫結合 1 h，ECL顯色，內參采用 β-actin。采用 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度分析。以VEGF條帶與內參β-actin條帶的灰度比值代表VEGF蛋白的表達水平。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 不同劑量姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF mRNA表達的影響

利用Primer 3.0軟件分別設計出擴增人VEGF和GAPDH mRNA的引物，Real-time PCR檢測VEGF mRNA的表達，見表1，并用EXCEL做出各組VEGF mRNA相對表達量柱狀圖表達，見圖1，姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對照組相比，VEGF mRNA的表達均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表1 姜黃素處理后，Lovo細胞VEGF mRNA和蛋白的相對表達（）

表1 姜黃素處理后，Lovo細胞VEGF mRNA和蛋白的相對表達（）

注：n=3，與對照組比較*P＜0.05。

組別VEGF mRNA表達（VEGF/GAPDH）VEGF蛋白表達（VEGF/β-actin）Control姜黃素5 μmol/L姜黃素10 μmol/L姜黃素20 μmol/L姜黃素40 μmol/L 0.422±0.015（0.253±0.016）*（0.198±0.009）*（0.166±0.011）*（0.116±0.009）* 0.0730±0.0042（0.0487±0.0030）*（0.0406±0.0048）*（0.0322±0.0057）*（0.0287±0.0025）*

2.2 不同劑量姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF蛋白表達的影響

不同劑量姜黃素處理Lovo細胞，收集細胞總蛋白，用Western Blot檢測VEGF蛋白的表達（結果見圖2），并用Image-Pro Plus6.0對圖像進行灰度分析（結果見表1，圖3），姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對照組相比VEGF蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖1 檢測姜黃素處理Lovo細胞VEGF mRNA的表達

圖2 檢測姜黃素處理Lovo細胞VEGF蛋白表達

圖3 檢測姜黃素處理Lovo細胞VEGF蛋白表達灰度比均值（n=3，P＜0.05）

3 討論

血管內皮生長因子VEGF隨著腫瘤增殖、侵襲和轉移而表達明顯升高[4]。VEGF信號還與腫瘤細胞的淋巴管、淋巴結侵襲及遠端轉移密切相關[5]。梁啟廉等研究發現VEGF表達水平與大腸癌組織學分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移有關[6]。且臨床觀察發現大腸癌患者術前血清VEGF水平與大腸癌的浸潤、轉移密切相關[7]。有研究者利用同源重組將結腸腸癌細胞系中VEGF-A敲除后發現，當細胞缺失了VEGF信號后，細胞的生長受到了明顯的抑制，且細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性增強[8]，而在臨床上僅僅通過阻斷細胞表面的VEGF受體來治療結直腸癌效果是有限的。

目前研究發現，姜黃素能夠對消化系腫瘤有很好的抑制作用，其藥理活性主要表現在能夠下調核轉錄因子（NF-k B）的活性，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人結腸癌HCT116細胞中，姜黃素可有效抑制結腸腺癌細胞集落生長和侵襲能力[10]。不同濃度姜黃素作用人結腸癌SW620細胞24 h，增殖抑制顯著[11]。

該研究用4種不同濃度的姜黃素分別作用Lovo細胞24 h后，利用Real-time PCR及Western Blot方法檢測VEGF的mRNA及蛋白的表達，發現各姜黃素組（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）與對照組比較，VEGF的mRNA及蛋白的表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且姜黃素的作用濃度越高，VEGF的表達量越低，該作用呈劑量依賴，提示姜黃素能通過抑制人結腸癌細胞Lovo中VEGF的表達來抗結腸癌血管形成，抑制結腸癌細胞的生長和轉移。此結果與賈佳等的觀點一致，他們發現姜黃素能夠下調結腸癌細胞HT-29中 β-catenin、VEGF的表達[12]。在多個結腸癌細胞系中，均有研究證實姜黃素能下調VEGF的表達，進一步可利用建立的結腸癌裸鼠移植瘤模型，從體內水平研究姜黃素能否下調瘤組織VEGF的表達，且姜黃素是否通過NF-KB信通路來下調人結腸癌細胞VEGF的表達，該機制也有待進一步研究。VEGF是抗癌藥物治療的新靶點，姜黃素作用后的人結腸癌Lovo細胞VEGF水平下降，提示姜黃素可能通過下調VEGF的表達抑制了VEGF促進腫瘤新生血管的作用，從而抑制了結腸癌的增殖和轉移。該研究為姜黃素的臨床應用提供新的理論依據。

[1]王倩，趙剛.姜黃素對結腸癌HCT-116細胞生長的抑制作用 [J].湖北中醫藥大學學報，2012，14(1):18-20.

[2]郭立達，焦振霞，宋瑛，等.姜黃素誘導結腸癌LoVo細胞凋亡的作用及機制研究[J].中國中藥雜志，2013，38(13):2191-2196.

[3]N Ferrara HPG，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors[J]. Nat Med，2003，9（6）：669-676.

[4]尤程程，黃利鳴.VEGF及其調控因素的研究進展[J].臨床與實驗病理學雜志，2011，27(12)：1344-1346.

[5]劉桂君，陳國江，黎燕，等.血管內皮生長因子在腫瘤生長轉移中的作用機制研究進展[J].國際藥學研究雜志，2012，39(5)：391-395.

[6]梁啟廉，陳小東，王三明，等.VEGF和metastin在大腸癌組織中的表達[J].南方醫科大學學報，2007，27(10)：1584-1587.

[7]李德川，馮海洋，徐笑紅.大腸癌患者血清VEGF水平的臨床研究[J].癌癥，2001，20(3)：314-316.

[8]Samuel S，Fan F，Dang LH，et al.Intracrine vascular endothelial growth factor signaling in survival and chemoresistance of human colorectal cancer cells[J].Oncogene，2011，30(10):1205-12.

[9]趙鵬，蔡輝.姜黃素藥理作用研究進展[J].中醫藥臨床雜志，2012，24 (4)：380-382.

[10]范鈺，張尤歷，許則豐.姜黃素抑制結腸癌SW620細胞侵襲的體外實驗研究[J].江蘇大學學報：醫學版，2006，24(4):298-300.

[11]羅強，孫黎，張力，等.姜黃素對人結腸癌SW620細胞凋亡機制的影響[J].中國老年學雜志，2011，24(16):3108-3109.

[12]賈佳，趙逵，張銀萍，等.姜黃素對人結腸癌細胞HT-29中β-catenin、血管內皮生長因子的影響[J].中國老年學雜志，2014，24(14)：3940-3942.

Effects of Curcumin on the Expression of VEGF in Human Colon Cancer Lovo Cells

YUAN QiZHANG Zheng HU Xiapxuan
Department of Hepatology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan Province,410005,China

Objective To study the effect of curcumin on the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells in vitro. Methods The human colon cancer cell lines Lovo were treated with 0 μmol/L,5 μmol/L10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L curcumin for 24 hours respectively,then we detected the human colon cancer cell lines VEGF mRNA expression by Real-time PCR and VEGF protein expression by Western Blot.Results After the human colon cancer cell lines Lovo cells treated with curcumin for 24 hours respectively,the expression of VEGF mRNA and protein of the curcumin-treated groups(5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L, 40 μmol/L)had more significant reduction compared with control group (P<0.05).Conclusion Curcumin could decrease the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells dose-dependently,this may provide some evidence for the mechanism that curcumin could inhibit the proliferation and invasion of colon cancer Lovo cells.

Curcumin;Colon cancer;Vascular endothelial growth factor

R587.1

A

1674-0742（2014）12（b）－0035-03

2014-09-16）（

2014-09-16）

袁琦（1983.1-），女，湖南邵東人，醫學碩士，醫師，研究方向：消化道腫瘤。