上皮細胞間質轉化與肺纖維化的研究進展

曾仁鳳 何振華 張秀峰

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）通常是慢性肺疾病最終的表現結果，是全球肺疾病發病率及死亡率的重要原因之一。肺纖維化是以多種原因引起的上皮細胞受損，修復障礙，上皮細胞活化、損傷，導致大量細胞因子釋放、細胞外基質沉積、異常間質細胞活化和增生為特征的疾病。其病理特點主要為大量間質細胞（成纖維細胞、肌成纖維細胞）積聚及增殖，而這些間質細胞來源尚不清楚。最近研究報道，這些細胞是通過上皮細胞間質轉化（epithlial to mesenchymal transition，EMT）而來的[1]。

1 EMT

EMT是細胞塑形的一種過程，上皮細胞失去極性，上皮細胞標志物丟失或下調，細胞骨架重建，細胞變成紡錘體形態，獲得間質細胞標記物，并且細胞的黏附能力減弱、增殖和遷移能力增強。

2 EMT的主要表型標志物

EMT發生時，上皮細胞標志物丟失，并獲得間質細胞標志物，代表上皮細胞的標志物主要有E-鈣粘素(E-cadherin，E-cad)，緊密連接蛋白 1（zonula occludens-1，ZO-1)；代表間質細胞的標志物主要有α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型膠原蛋白（col type I）、纖維連接蛋白（fibronectin）、纖維狀肌動蛋白（F-actin）。下面介紹3種肺纖維化中EMT的主要表型標志物。

2.1 E-cadherin E-cadherin，是典型的EMT上皮細胞標志物[2]。E-cad，分子量大小為120 KDa，廣泛分布于胚胎和成熟組織上皮細胞中，位于同種上皮細胞側面的中間連接處，是一類介導細胞之間互相黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，參與介導上皮型細胞—細胞間的黏附、胚胎發育以及正常組織中上皮細胞層的形成和維持，是細胞連接的重要分子。人類E-cad基因位于16 q 22.1 附近，由723～748個氨基酸組成，包括N端胞外區、高度疏水的跨膜區及C端胞內區。N端是Ca2+的結合位點，對Ca2+有高度敏感性，通過與Ca2+特異性結合而發揮黏附功能；胞內區通過連環素（catenin）與微絲、中間絲、肌動蛋白相連接，形成復合體，使E-cad被錨定于細胞骨架上，與相鄰細胞形成穩定連接[3]。當組織受到損傷時，在修復過程中，上皮細胞間E-cad連環素復合物及其核心骨架蛋白發生酪氨酸磷酸化，破壞了該復合體結構的完整性，使得E-cad不能準確定位于膜上，胞漿內蛋白酶將其降解進入胞漿，喪失其黏附的能力，增加了上皮細胞增殖和遷移能力，從而促進上皮細胞的再生修復。

2.2 a-SMA a-SMA是一種間質細胞標志物，由血管平滑肌機細胞及肌上皮細胞表達。a-SMA是一種中等大小的蛋白質，由375個氨基酸組成，分子量為43 KDa。a-SMA被認為是肌成纖維細胞的一種標志物，而這些肌成纖維細胞來自于上皮細胞間質轉化，并且與肺纖維化有關[4]，a-SMA的表達與肺纖維化的進展是成正相關的。

2.3 Vimentin Vimentin是常見的EMT間質細胞標記物，來源于成纖維細胞、內皮細胞和白細胞等中胚層細胞。Vimentin是中間纖維家族中的一員，構成間質細胞中最主要的中間纖維，其重要功能是與微管、微絲共同形成一個細胞支架網絡而維持細胞完整性。人的vimentin基因位于人類染色體10 p 13上，相對分子量大小約為57 KDa，總共編碼466個氨基酸。Vimentin由頭部的氨基端（N端）、尾部的羧基端（C端）和兩端之間的螺旋桿狀區3部分構成，不僅參與腫瘤分化、轉移和增殖有著密切的關系，還在細胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等生理功能中起重要作用。在炎癥的修復過程中，多種細胞因子的參與下，上皮細胞間質轉化發生時，波形蛋白的表達上調[5]。

3 EMT促進了肺纖維化

EMT是目前肺纖維化發病機制的研究熱點，在肺纖維化的形成中扮演了非常重要的角色。EMT是肺纖維化重要的病理過程[1,6]。EMT是上皮細胞失去極性，上皮細胞標志物丟失或下調，細胞骨架進行重建，細胞變成紡錘體形態，并獲得間質細胞標記物的過程[7]。EMT分為3型，Ⅰ型EMT參與胚胎發育、器官形成，Ⅱ型EMT在肺纖維化中發揮作用，Ⅲ型EMT與腫瘤形成、進展有關[8]。很多研究證明EMT與肺纖維化有著密切的關系[5-6,9]。博來霉素誘導的肺纖維化小鼠的肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AECs）及氣道上皮細胞（bronchial epithelial cells，BECs）發生了上皮細胞間充質轉化[6]，實驗結果是上皮細胞標志物E-cad的表達下降，而間質細胞標志物a-SMA、F-actin的表達增加。在C^amara[9]的研究中，人的氣道上皮細胞（human bronchial epithelial cells，HBECs)）也發生了上皮細胞間質轉化，導致E-cad的丟失，獲得vimentin、a-SMA。同樣，Milara等[5]的研究，無論是在體外實驗的A 549細胞中，還是在體內實驗的特發性肺纖維化患者中，都證明了上皮細胞間充質轉化,伴隨上皮細胞標志物ZO-1、E-cadherin的下調，間質細胞標志物α-SMA、vimentin、col type I的上調。這些研究表明EMT的發生促進了肺纖維化的形成。

4 EMT促進肺纖維化的信號通路

4.1 TGF-β/smad通路 轉化生長因子β（TGF-β）是一種多功能的細胞因子，通過影響細胞的增生、分化、凋亡、細胞外基質生成來調節組織的形態發生及分化，被譽為是誘導縱多組織（包括肺組織）纖維化的總開關。在正常的哺乳動物上皮細胞中，TGF-β是肺纖維化中上皮細胞間質轉化的主要誘導者，包括腎小管上皮細胞、角膜上皮細胞和肺泡上皮細胞[7]。在Kasai等[10]的研究中，使用TGF-β處理的A 549細胞，相差顯微鏡檢查發現肺泡上皮細胞發生了形態學的改變，并且檢測到成纖維細胞表型標志物vimentin的表達上升，上皮細胞標志物E-cad表達下調，同時致纖維化因子Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及結締組織生長因子（CTGF）的表達升高。這個研究證明了TGF-β能夠誘導肺泡上皮細胞發生EMT，而且此項研究還證明了TGF-β誘導EMT是通過活化了的Smad 2。另外，還有研究證明Smad 3也參與了EMT[7]。

TGF-β/Smad信號通路是參與肺纖維化EMT的重要轉導途徑。Smad是肺纖維化EMT信號通路中TGF-β的下游底物。TGF-β家族細胞受體是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，TGF-β與其胞膜上的受體結合磷酸化進入胞漿，將信號傳遞給胞漿內的Smad 2與Smad 3，磷酸化的Smad 2與Smad 3再與Smad4結合形成復合體，激活胞核內的核轉錄因子，從而啟動一系列的反應，促進纖維化的形成。

核轉錄因子包括Snail家族、ZEB家族和helix-loophelix(HLH)家族[11]。Snail屬鋅指轉錄因子，其成員包括Snail 1、Snail 2（又稱Slug）和Snail 3。在肺纖維化中，主要是Snail1 參與，Smad與Snail1啟動子結合，然后進行轉錄，Snail1通過識別E-cad，并且與E-cad啟動子部位的E-box結合，從而抑制E-cad的表達。在Kim等[12]的研究中，TGF-β介導的A 549細胞不盡發生了EMT，還發現Snail1的高表達導致E-cad的丟失。這就表明Snail1與EMT有著密切關系。ZEB包括ZEB1和ZEB 2，ZEB蛋白誘導及調節下游的E-cad，使其表達減少，并且促進細胞的遷移。HLH包括蛋白E 12、E 47、Twist、Id等，也參與了EMT。

4.2 非Smad通路 TGF-β介導的EMT的途徑縱多，主要是依賴Smad的信號通路，也是當前研究最熱門的信號轉導途徑，還有其他非Smad的信號通路，包括RhoA/Rock、MAPK、PI3 K/AKt、Wnt等信號通路。

4.2.1 RhoA/Rock 在貂的肺上皮細胞和小鼠乳腺上皮細胞中，小G蛋白RhoA及其下游的Rock被證明參與了TGF-β介導的EMT，對EMT過程中細胞骨架的重排扮演了非常重要的角色[13]。

4.2.2 MAPK TGF-β可以激活MAPK，激活的MAPK影響細胞的緊密連接，細胞骨架重排，促進細胞的遷移，導致上皮細胞向間質細胞轉變[11]。

4.2.3 PI3 K/AKt TGF-β通過酪氨酸激酶受體快速激活PI3激酶，是通過Akt激酶活化mTOR/S6激酶1，導致蛋白的合成增加及細胞的增生，參與EMT，抑制間質細胞表型標志物E-cad的表達下降[3]。

4.2.4 Wnt Wnt蛋白本身不能誘導EMT，典型的Wnt信號通路是被β-catenin調節的。β-catenin是細胞緊密連接的一部分，連接細胞骨架間的E-cad。如果Wnt信號被活化，將抑制GSK-3 β，導致胞質中的β-catenin大量累積[11]。激活Wnt信號，抑制GSK-3 β，可以下調E-cad的表達，從而調節EMT[14]。

5 結論

肺纖維化呈進行性發展，是呼吸系統最嚴重慢性疾病之一，最終導致呼吸衰竭而亡。目前肺纖維發病機制尚不清楚，缺乏有效的治療手段。TGF-β介導的EMT在肺纖維化形成機制中扮演了非常重要的角色，因此加強對EMT的科學研究，為肺纖維化的治療提供新靶點。

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