基因修飾小鼠的骨性關節炎模型研究進展

蔡大衛 蔣青

骨性關節炎（OA）的模型動物有很多，但長期以來可做基因修飾（基因敲除、基因表達及基因轉染）的動物只有小鼠，雖然已有大鼠敲除的相關報道，但尚不成熟。

基因修飾（GM）小鼠，以敲出小鼠為例，越來越多應用于骨性關節炎的分子機制研究和治療靶點尋找上，相關文獻呈逐年增加的趨勢。在PUBMED對2013年文獻（至11月）以關鍵詞mouse/mice和osteoarthritis/OA檢索，有41篇用到敲除小鼠，其中 10 篇[相關分子：AnxA6，MIP-1 γ，ADAMTS-7，fat-1，Lrp6，RAGE，sirt1，adamts5，mmp13，CB1（2）]對小鼠進行了OA造模。因此，小鼠OA模型因其特殊的價值有整理歸納的必要。

1 模型分類及相關介紹

單獨對小鼠OA模型的分類尚缺，本文在造模的操作水平上將已有的小鼠模型（非自發）分為關節腔注射類和手術切斷（除）類兩種。

1.1 關節腔注射類

1.1.1 注射碘醋酸鹽（MIA）誘發OA 將小鼠膝關節彎曲90°以露出關節間隙，用30G針頭穿過髕下韌帶后注射5～10μl濃度為5mg/ml的MIA溶液進入小鼠膝關節。作用20～30d后可有明顯病理和組織化學差異[1]。造模機理是它可以通過抑制軟骨細胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶阻斷糖酵解過程，繼而軟骨結構的完整性可因軟骨細胞功能不全受損，軟骨下骨裸露后可有疼痛和機械高敏性出現。模型可模擬OA發病過程中基質降解現象，有顯著關節疼痛出現。其基質降解多累及髕骨中部和內外側脛骨平臺的中部。除了2007年Boileau利用此模型敲除鼠研究galectin-3對OA的作用外，近年來的研究多和OA疼痛（pain）相關，如2013年Carmen使用的CB1、CB2敲除小鼠。

1.1.2 TTR模型 即TGFbeta1注射以及跑步機模型。給小鼠單側膝關節腔內注射TGFb1（200ng），48h后再注射1次。之后每天以32cm/min的速度進行20min的17°上斜坡強制跑步（跑步機），持續2周。本模型可以通過改變小鼠最終處死的時間獲得急慢性不同時相的模型數據[2]。同時，此模型在ADAMTS5、CD44等敲除小鼠上都可比較軟骨侵蝕，關節周圍纖維化，和滑膜以及半月板的變化。此外，Anna配合此模型進行錄像步態分析以比較OA嚴重程度。

1.1.3 膠原酶（Collagenase）注射 注射細菌膠原酶進入小鼠膝關節腔中，注射量6μl，濃度可為1.0%(w/v)，造模時間7～42天，該模型可于不同時間處死小鼠以觀察不同時相OA樣改變。模型早期有軟骨纖維化和基質降解，后期發展為軟骨下骨磨損以及骨贅形成[3]。造模機理：膠原酶可以破壞主要的關節結構如肌腱、韌帶、半月板，引起關節不穩定性增加。膠原酶注射模型的骨性關節炎樣損害主要表現在關節內側，但對于大齡小鼠外側也會累及（也有報道說最受累區域是和注射的位置有關）。此模型的OA樣表現不僅限于關節軟骨，滑膜和韌帶都會累及。

1.1.4 抗原誘導的OA模型（AIA） 在小鼠尾巴基部注射100μg溶于乳化劑中的mBSA，以及100μl Freund佐劑。這樣免疫以后的第10天，可在小鼠膝關節腔內注射入10μl含100μg mBSA的溶液。模型在免疫后第17天完成[4]。

1.1.5 木瓜蛋白酶 往小鼠膝關節腔中注入已被L-半胱氨酸激活后的濃度1% (w/v)的木瓜蛋白酶溶液6μL，3周后有顯著OA樣改變，可累及軟骨面、韌帶、滑膜，而遠期（9周）軟骨下骨的硬化改變不是很顯著[5]。

1.2 手術切斷（除）類主要包括 （1）DMM：切斷連接內側半月板（MM）和脛骨平臺的半月板脛骨韌帶（MMTL）[6]；（2）ACLT：前交叉韌帶（ACT）可以限制脛骨前移動起到穩定關節的作用，本模型就是切斷前交叉韌帶[7]；（3）內側副韌帶（MCL）切斷聯合內側半月板切除[8]；（4）完全或者部分的半月板切除術[9]。

Kamekura[10]通過不同韌帶和（或）半月板切斷（除）的組合模擬了4種不同嚴重程度的OA手術模型，分別為：（1）輕微：前交叉韌帶切斷（ACL）；（2）適度：前交叉韌帶聯合內側半月板切除(ACL+MM)；（3）中度：內側副韌帶聯合內側半月板切除(MCL+MM)；（4）嚴重：髕韌帶合內外側副韌帶，內外側半月板，前后交叉韌帶全切除(PL+MCL+MM+ACL+PCL+LM+LCL)。

小鼠的手術造模的原理都是利用關節結構上的不完整增加關節不穩定性，這樣長遠可以加速關節軟骨的磨損。造模完成一般需要4～8周，不同的模型的操作復雜性和病程發展的觀察可控性都有差別。在2013年已發表的有關GM小鼠OA造模文章中都有使用到手術法。

2 實驗模型的選擇

OA病癥紛繁復雜，可歸納出疼痛、功能障礙，病理生化改變3個主要方面。目前模型小鼠多用于模擬病理生化改變。

可根據模型特色選擇合適造模法，如近來MIA注射模型的OA研究多集中于疼痛學方面；手術造模的軟骨基質降解和破壞非常顯著；而TTR跑步機模型則可獲得不同嚴重程度和急慢時相的OA模型，同時可行步態分析評估功能改變。

其次，需要考慮到實驗外部條件限制，比如時間成本。注射藥物造模時間一般小于1個月，而手術造模則需要1～3個月。另外，像MIA、木瓜蛋白酶、膠原酶、抗原免疫及跑步機模型都需要有小鼠關節腔注射工具。在手術造模中，不同的術法難度也不一樣，如因為有后十字韌帶(PCL)干擾，前交叉韌帶（ACLT）切斷術相對DMM較為復雜，要求實驗者有較為熟練的操作技巧。

同時，可以在實驗中使用多模型同時驗證以增加可靠性和說服力，不同模型的組合尚沒有明確說法。最后，從動物保護角度出發，應盡量遵從3R原則。

3 小鼠模型的不足和展望

OA是個年齡相關性疾病，可是目前模型使用的實驗鼠多是年輕鼠（10周內），無論是關節的疼痛，功能障礙還是組織化學的改變都沒有把年齡相關因素考慮在內。此外，小鼠的骨骼成熟后剩余壽命比例相對于大動物（豬、狗）較小，這部分時間對于OA進展至關重要，所以也就可能相對限制了實驗中模型小鼠OA樣改變的進展。

OA是全身性疾病，而小鼠模型大多集中研究膝關節。研究主要關注模型小鼠軟骨破壞，對其他組織如韌帶、關節囊、肌肉等鮮有涉及。同時，個別造模效果需要重新驗證，如小鼠手術模型模擬創傷性關節炎方法尤多，但是文獻中給的相關的疼痛，運動障礙，生化改變的數據甚少以至于無法全面判斷模型效果。

模型構建過程，GM小鼠（特別是全身某基因敲出）可能會在行為上和同遺傳背景的普通鼠有區別（如生病、活動量、進食量），目前尚沒有相關報道討論這是否會對實驗最后基因修飾因素產生的差異性結果造成影響。

綜上所述，雖然存在不足，但總的來說，對于骨性關節炎研究除了小鼠在基因修飾方面的無可比擬的優勢以外，小鼠購買和飼養成本低和操作相對簡單的好處都是顯而易見。因此，隨著OA研究的進一步深入及GM小鼠的逐漸普及，小鼠骨性關節炎模型有必要進行廣泛而細致的研究、探討和系統歸類。

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