中縫大核對大鼠心臟傷害性感受的下行抑制性調控作用及其調控通路

孫 娜，牛利剛，孔令恒，朱娟霞，徐 燕，杜劍青

（1.西安醫學院基礎醫學研究所生理學教研室，陜西 西安 710021；2.西安交通大學醫學院生理學與病理生理學系，陜西 西安 710061）

腦干對脊髓背角傷害性信息的傳入具有下行抑制性調控作用，電刺激中縫大核（nucleus raphe magnus，NRM）或者于NRM內注射谷氨酸或5－羥色胺（5－hydroxytryptamine，5－HT）等受體激動劑，可以對由傷害性軀體或者內臟刺激引起的脊髓傷害感受性反射或者脊髓背角神經元進行抑制性調節，而NRM的這種下行抑制性調節作用在解剖學上被認為是由脊髓背外側束（dorsolateral funiculus，DLF）下行介導的［1－2］。另外有研究［3］顯示：5－HT能神經元主要集中在腦干的NRM，其下行纖維可達脊髓膠質區／側角和前腳，尤其是從NRM至脊髓后側角的5－HT神經通路，因此脊髓內5－HT遞質的釋放被認為是腦干下行抑制系統參與鎮痛作用的主要因素。然而，這些研究都是以軀體痛或者直腸和膀胱腹部內臟痛為研究靶點，而關于心臟痛的腦干下行性調節卻少有研究。為了進一步探討NRM對心臟傷害性感受的下行性調控作用以及參與其中的脊髓通路和5－HT受體系統的作用，本實驗采用Jou等［4］人建立的大鼠心臟－軀體運動反射（cardiosomatic motor reflex，CMR）模型，以心包內注射致痛劑辣椒素（capsaicin，CAP）誘發背斜方肌（spinotrapezius，SPT）肌電（electromyogram，EMG）為指標，分析EMG的變化，探討NRM對心臟傷害性感受的調節作用及其調控通路，為心絞痛的臨床神經治療研究提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 實驗選用成年、雄性、健康的Sprgue Dawley（SD）大鼠，體質量250～350g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：0008366。大鼠在標準清潔級環境中飼養，室溫20℃～25℃，12h晝夜循環光照，自由攝食飲水。在保證實驗統計的基礎上盡量減少實驗動物使用的數目。戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）溶于生理鹽水，配制成2×10－2g·mL－1溶液用于動物初始麻醉，1×10－2g·mL－1溶液用于動物麻醉維持；CAP（美國Sigma公司）溶于吐溫80和無水乙醇混合溶液（按1∶1的配比）中，配制成1×10－3g·mL－1的母液，待實驗當天用生理鹽水稀釋到濃度為1mg·L－1；麥角新堿（美國Sigma公司，5－HT受體拮抗劑）溶于二甲基亞砜溶液中，待麥角新堿完全溶解后，再將溶有麥角新堿的二甲基亞砜溶液與生理鹽水按照3∶7的體積比混合，配制成濃度分別為3×10－3g·mL－1和5×10－3g·mL－1溶液。PowerLab信號采集與分析系統（澳大利亞AD Instruments公司），蠕動泵（BT100－2J，保定蘭格恒流泵有限責任公司），小動物呼吸機（DW3000－B，淮北正華生物儀器設備有限公司），溫度控制儀（原西安醫科大學教學儀器廠），動物腦立體定位儀（SN－2N，日本Narishige公司），雙線記憶示波器（VC－10）、雙通道放大器（AVM－11）、刺激器（SEN－3301）和隔離器（SS－202J）（日本Nihon Kohden公司）。

1.2 實驗方法 所有大鼠均以2×10－2g·mL－1戊巴比妥鈉（45～55mg·kg－1）腹腔麻醉，行常規氣管插管和頸外靜脈、頸總動脈插管術后，制備CMR大鼠模型：于大鼠左側上胸部第1到第3肋軟骨處行開胸術，暴露胸腺和心臟，用玻璃探針在心包膜上開一小孔，將一內徑0.051cm、外徑0.094cm，長度14～16cm、遠端有數個小洞的硅膠管順胸腺的中線由之前在心包上所開的孔插入心包，導管順左心室表面插入約2cm并縫合在胸腺和各層胸壁組織之間予以固定。心包內可反復注入和抽出液體。每一次從導管內抽出的液體均作為廢棄液被處理，以免污染下一次實驗。實驗開始時，于T4～T6水平暴露大鼠左側背斜方肌（spinotrapezius，SPT），插入同芯電極記錄大鼠EMG反應，EMG信號經AVM－11雙通道放大器（Nihon Kohden）放大后，由PowerLab軟件采集和分析，濾波為1000～3000Hz。實驗中維持大鼠于淺麻醉狀態（1×10－2g·mL－1戊巴比妥鈉，10～15mg·kg－1·h－1），體溫保持（37.0±0.5）℃。

1.3 實驗分組及處理方法 大鼠隨機分為NRM電刺激組（n＝8）、NRM電刺激聯合DLF橫斷組（n＝8）和NRM電刺激聯合5－HT受體拮抗劑鞘內微注射組（n＝18）。①NRM電刺激組：為實現電刺激大鼠NRM區的目的，根據Paxions ＆Watson圖譜，將一根外徑0.45mm的鋼制導管植入大鼠腦干NRM區上方2mm處（前囟后9.4～11.8mm，腦表面下7.0～7.4mm，中線旁開0～0.5mm）。同芯刺激電極經此導管進入NRM區，使其尖端位置長于導管尖端2mm。每只大鼠在行NRM電刺激前，先行單純CAP（0.2mL，1mg·L－1）心包內注射，其誘發的EMG活動作為基礎對照；間隔50min，給予大鼠NRM電刺激（75μA）及心包內CAP注射，觀察NRM電刺激對心包內注射CAP所誘發EMG反應的影響；50min后，再次心包內注射CAP，觀察EMG恢復情況，作為后對照。為保證實驗數據的準確，每次CAP刺激后，用溫生理鹽水沖洗心包腔5～6次，每次0.2mL，去除心包內殘留的CAP，每次心包CAP刺激時間間隔50min，以避免藥物耐受性現象的出現。②NRM電刺激聯合DLF橫斷組：為實現觀察脊髓下行調控路徑的目的，對大鼠實施C1～C3節段的開錐板術并將硬脊膜完全剝離，暴露脊髓組織，實驗需要時用精細眼科剪解剖學橫斷DLF。實驗過程：CAP心包內注射，記錄EMG活動作為基礎對照；50min后行NRM區電刺激（75μA）及心包內CAP注射，記錄EMG以觀察NRM的下行性調控作用；繼而用精細眼科剪實現DLF解剖學阻斷，50min后再次行NRM區電刺激（75μA）及心包內CAP注射，記錄EMG活動以判斷DLF橫斷對NRM下行性調控作用的影響。DLF被橫斷后，血壓下降，但50min內血壓便得以恢復至基線水平。③NRM電刺激聯合5－HT受體拮抗劑鞘內微注射組：為觀察5－HT受體拮抗劑麥角新堿在NRM下行性抑制性調控中的作用，對大鼠實施脊髓鞘內置管術，即將一根規格為PE10的導管通過枕骨大孔植入至脊髓T3～T5節段，插入深度為3.5～4.0cm，為后期脊髓內藥物注射做準備。實驗過程：先行CAP心臟刺激記錄EMG活動作為基礎對照；繼而NRM電刺激（75μA）及心包內注射CAP，記錄EMG以觀察NRM的下行性調控作用；間隔50min，鞘內注射溶媒（10μL）或麥角新堿（30或50μg，10μL），15min后，行NRM區電刺激（75μA）及心包內CAP注射，記錄EMG活動以觀察麥角新堿鞘內注射對NRM電刺激的影響；50min后，行NRM區電刺激（75μA）并心包內注射CAP，記錄EMG以判斷藥物作用的持續時間。實驗結束后，將實驗中所記錄的EMG用PowerLab軟件進行頻率直方圖處理。當放電頻率高于3imp·s－1時，作為放電的開始；當放電頻率低于3imp·s－1時，則作為放電的終止，從而得到每次CAP心包內注射所誘發的肌電反應總個數（total number of motor unit discharges，TMUD）。每只大鼠第1次心包內注射CAP所誘發的肌電反應的TMUD被標化為100%，作為基礎對照（control），其后續肌電反應均以第1次心包內注射CAP所誘發的肌電反應的TMUD為分母進行標化，以消除大鼠個體間的差異。電刺激后肌肉放電單位數高于基礎對照110%或者低于對照90%，視為有意義，可計入統計范疇［5］。

1.4 統計學分析 采用SPSS 10.0統計學軟件進行統計分析。各組大鼠CAP誘發的背斜方肌EMG的變化率以表示，組內各處理因素之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗。

2 結 果

2.1 NRM電刺激下大鼠CMR的變化 當給予NRM 75μA的高強度電刺激時，大鼠EMG反應為基礎對照的（48.15±6.10）%，明顯低于基礎對照（P＜0.05）；間隔50min后，后對照恢復良好，為基礎對照的（96.16±1.63）%，與基礎對照比較差異無統計學意義（P＞0.05）。NRM對CAP誘發的EMG反應抑制性調節效應的原始肌電實例圖見圖1A，NRM電刺激位點組織再建圖見圖1B。

2.2 NRM電刺激作用下大鼠CMR下行抑制性調節脊髓通路的變化 于C1－C2脊髓節段行雙側DLF橫斷術，解剖學阻斷脊髓DLF下行通路。DLF阻斷前，75μA電刺激NRM的抑制效應為基礎對照的（52.08±6.60）%（P＜0.05）；DLF阻斷后，NRM電刺激的抑制效應消失，為基礎對照的（91.82±2.42）%（P＞0.05）；DLF阻斷前NRM電刺激所產生的肌電效應與DLF阻斷后比較差異有統計學意義（P＜0.05）。DLF橫斷面積實例圖見圖2。

圖1 電刺激NRM對CAP誘發EMG的抑制性調節效應原始肌電實例圖（A）及NRM電刺激位點組織再建圖（B）Fig.1 Raw traces of NRM stimulation－induced inhibitory modulation of EMG responses to CAP from one rat（A）and locations of electrical stimulation sites in NRM（B）

圖2 脊髓C2節段DLF橫斷面積實例圖Fig.2 DLF transection area at C2level of spinal cord

2.3 麥角新堿對NRM電刺激下行抑制性調節的翻轉效應 NRM電刺激聯合鞘內微量注射5－HT受體拮抗劑麥角新堿（30和50μg）后所產生的EMG反應與NRM電刺激比較差異有統計學意義（P＜0.05），但仍未恢復至基礎對照水平（P＜0.05）；NRM電刺激聯合鞘內注射麥角新堿溶媒所產生的EMG反應與NRM電刺激比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

本實驗結果顯示：電刺激NRM可以對CMR產生抑制調節作用；DLF橫斷實驗表明NRM的下行抑制性調節是經脊髓通路DLF實現的；鞘內注射5－HT受體拮抗劑麥角新堿部分翻轉了NRM的下行性抑制效應，說明5－HT參與了NRM對心臟傷害性感受的下行抑制性調節。

表1 麥角新堿鞘內注射對NRM下行抑制性調控作用的影響Tab.1 Influence of methysergide intrathecal administration in descending inhibitory modulation of NRM（n＝6，，η／%）

表1 麥角新堿鞘內注射對NRM下行抑制性調控作用的影響Tab.1 Influence of methysergide intrathecal administration in descending inhibitory modulation of NRM（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05compared with control；△P＜0.05compared with NRM stimulation.

Group ide＋NRM stimulation NRM stimualtion Methysergide 30μg 100.0046.94±4.12＊71.50±2.66＊△47.05±5.01 EMG Program：Control NRM stimulation Methyserg＊Methysergide 50μg 100.0044.77±4.44＊70.76±4.67＊△51.00±3.94＊Vehicle 100.0043.10±6.91＊42.15±5.51＊42.00±4.33＊

目前，大多數學者認為腦干內源性下行抑制系統主要由中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray，PAG）、延髓頭端腹內側核群（rostral ventromedial medulla，RVM）和一部分腦橋背外側網狀結構組成，經脊髓DLF下行對延髓和脊髓背角痛覺感受性信息的傳入產生抑制性調制［6］。而NRM為RVM核群內最重要的一個核團，是內源性鎮痛系統的一個重要的中繼站。在NRM內存在3類神經元：“停止”神經元（off－cell）、“啟動”神經元（on－cell）和“中性”神經元（neutral cell）。許多研究［7－10］發現：當給予NRM高強度的電刺激（50～200μA）時，可以通過激活off－cell，抑制oncell，從而對軀體或內臟傷害性刺激起到抑制性調節作用，如甩尾反射、熱板反射和直腸／膀胱－軀體運動反射等，然而這些有關的研究均局限于軀體痛和腹部臟器痛，有關心臟傷害性感受的研究很少。本實驗采用了一種新的動物模型，通過CMR證明了NRM對心臟傷害性感受同樣具有抑制性調節作用。

另外許多資料證實脊髓DLF參與痛覺下行抑制調節。Chandler等［11］研究報道脊髓電刺激（spinal cord stimulation，SCS）可以抑制由心臟內注射緩激肽（bradykinin，BK）引起的胸段脊髓丘腦束神經元的興奮活動。Zhou等［1］研究報道：NRM對內臟傷害性感受的抑制性調節效應是通過脊髓DLF介導的；在大鼠直腸放置膨脹氣囊產生內臟傷害性刺激，觀察脊髓背角神經元的電活動，當給予NRM高強度電刺激（50～200μA）時，可減少脊髓背角神經元的神經沖動，而在橫斷DLF后，這種抑制效應隨即消失。本實驗結果也提示：雙側DLF橫斷后，NRM對CMR的下行性抑制性調節被阻斷，與以往研究結果一致。綜合以往的研究資料以及本實驗結果，本文作者認為：高強度的電刺激可能主要激活了NRM內off－cell，而off－cell的神經沖動主要通過脊髓DLF下行發揮調節作用。

解剖學研究發現NRM約50%的神經元為5－HT能神經元，Potrebic等［12］采用抗體微電極技術發現NRM內的off－cell／on－cell／neutral－cell均呈5－HT免疫陽性反應，其中5－HT免疫陽性反應在neutral－cell分布最多，off－cell次之，on－cell最少。而這些5－HT能神經元80%以上為縫－脊投射神經元，即其投射纖維主要經脊髓DLF下行，分布于同側脊髓后角，可通過軸－軸突觸影響脊髓后角的傷害性感受神經細胞的活動，從而在痛覺調制中發揮鎮痛作用。然而，5－HT對脊髓傷害性反應的調控是復雜的，可能產生抑制作用，也有可能產生易化作用，這可能歸因于激活的受體亞型不同、藥物注射的劑量不同或者傷害性刺激類型不同。有研究［13－16］顯示：脊髓的5－HT1、5－HT2和5－HT3受體與鎮痛效應有關。麥角新堿作為非選擇5－HT1和5－HT2受體的拮抗劑被廣泛使用。本研究通過鞘內注射麥角新堿部分翻轉了電刺激NRM對CMR的抑制作用，提示5－HT及其受體參與NRM對CMR的下行性抑制作用，即高強度電刺激可能主要激活了NRM內的off－cell，off－cell的神經沖動通過脊髓DLF通路下行，促使大量的5－HT釋放至脊髓背角，導致脊髓背角感覺神經元超極化，從而明顯提高了疼痛的閾值，而一旦麥角新堿阻斷了脊髓背角感覺神經元上的5－HT受體，導致5－HT的抑制作用減弱或消失。即使鞘內注射高濃度的麥角新堿（50μg）也沒有完全阻斷NRM對CMR的抑制效應，這說明還有其他脊髓受體參與了源自NRM的抑制性調節過程。研究［14］顯示：雖然NRM內5－HT能神經元為主導，但是還有不到50%的神經元為去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、多種神經肽和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）能神經元，其中5－HT與NE、5－HT與阿片肽、5－HT與GABA以及GABA與阿片肽等也多有共存現象，而這些神經元的活動之間存在著復雜的構筑關系，至今還不十分清楚。

綜上所述，本實驗中給予NRM電刺激可以減弱大鼠SPT的緊張性反應，而DLF和5－HT下行纖維系統參與NRM對CMR下行性抑制性調節。臨床上許多患者在經歷過心絞痛后，會出現上胸部肌肉緊張性的增加，這與本實驗中的大鼠模型相似。本研究結果將為心絞痛的臨床神經治療研究提供有效的基礎研究資料。

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