EMMPRIN糖基化突變質粒的構建及功能檢測

趙超悅，宋潤敏，秦 暉，王 娜，楊 柳，李 江

（1.吉林大學口腔醫(yī)院口腔修復科，吉林 長春 130021；2.東北師范大學生命科學學院膜通道實驗室，吉林 長春 130024）

細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）又稱CD147，其高表達在腫瘤中較為常見。近幾年來EMMPRIN是腫瘤領域中的研究熱點。EMMPRIN在多種正常上皮細胞表達，但其表達水平較低；而在腫瘤細胞中表達水平較高，例如在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和結腸癌等多種惡性腫瘤細胞中均高表達［1－4］。EMMPRIN表達水平與腫瘤進展關系密切，其高表達能夠反應出腫瘤的惡性進展和高死亡率，并能預測其不良預后。EMMPRIN作為膜蛋白是基質金屬蛋白酶（MMP）的重要誘導因子，通過調節(jié)MMP水平促進腫瘤細胞的遷移。然而，EMMPRIN與腫瘤細胞的增殖關系尚不清楚，EMMPRIN是否影響腫瘤細胞的增殖／凋亡信號需要深入研究。EMMPRIN作為一種在機體中廣泛存在的跨膜糖蛋白，其生物學功能的發(fā)揮很大程度依賴于與蛋白質相連接的糖鏈，不同的糖基化形式賦予其不同的生物學功能，尤其表現(xiàn)在腫瘤侵襲及轉移過程中［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)：腫瘤細胞表面糖基化異常與腫瘤細胞的侵襲和轉移有密切關系，這些變化包括糖鏈結構在表達水平上的差異以及特殊糖鏈結構的出現(xiàn)。但尚無針對EMMRPIN糖基化位點突變的相關報道，本研究主要針對EMMPRIN預測的3個糖基化位點構建單點突變質粒，研究其糖基化位點突變后對EMMPRIN蛋白穩(wěn)定性和功能方面的影響。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株、主要試劑和儀器 EMMPRIN／GFP質粒由華盛頓大學Dr.Pushparsky設計［7］并惠贈；大腸桿菌DH5α和人胚胎腎臟細胞HEK293T由東北師范大學遺傳所提供；細胞培養(yǎng)所用試劑購自美國Gibco公司；限制性內切酶BamHⅠ、ExTag DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白相對分子質量標準品及質粒提取試劑盒購自美國Pronega公司；EMMPRIN多抗體購自SanTa CRUZ Biotechnology公司，產(chǎn)品貨號為SC－13976。Bioer TC－96／T／H（a）基因擴增儀購自杭州博日科技有限公司，LX－100手掌型離心機購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，XW－80A旋渦混合器購自上海精科實業(yè)有限公司，JY 200C電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司，電子天平購自梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.2 引物設計 采用Megaprimer PCR技術，根據(jù)EMMPRIN／GFP序列和突變位點自行設計3組6條引物，EMMPRIN序列中第44、152和186位設計的引物序列分別為第44位：上游引物5′－TCCTTGCAGGACAGCGCCACAGAG－3′，下游引物5′－GCTGTCCTGCAAGGAGCAGGTGAG－3′；第152位：上游引物5′－CTCATGCAGGGCTCCGAGAGCAGG－3′，下游引物5′－GGAGCCCTGCATGAGGGCCTTGTC－3′；第186位：上游引物5′－CGGTGCCAGGGCACCAGCTCCAAG－3′，下游引物5′－GGTGCCCTGGCACCGGTACTGGCC－3′，其中下劃線為引入突變氨基酸的密碼子。PCR反應：采用50μL體系，10×PCR反應緩沖液5μL，上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，dNTP（2.5mmol·L－1）4μL，模板（0.5mg·L－1）2μL，ddH2O 36μL，最后加Ex Tag DNA聚合酶（2.5U·μL－1）1μL。PCR擴增條件：95℃預變性1min；95℃變性40s，60℃退火1min，68℃延伸10min；72℃延伸、補全10min；循環(huán)數(shù)：12個。DpnⅠ消化：DpnⅠ消化PCR產(chǎn)物，酶切體系DpnⅠ（10U·μL－1）1μL，10×DpnⅠ反應緩沖液5μL，PCR產(chǎn)物44μL，37℃保溫1h。轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，取5μL DpnⅠ消化PCR產(chǎn)物，加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，輕輕混合，冰浴30min，42℃熱休克90s，再冰浴2min，最后全部涂布于氨芐青霉素抗性LB平板（氨芐青霉素濃度為1000mg·L－1），37℃溫箱過夜培養(yǎng)。

1.3 提取質粒、酶切鑒定及測序 挑取單菌落，堿法提取質粒，用BamHⅠ行酶切鑒定，10μL酶切體系：BamHⅠ1μL，10×反應緩沖液1μL，待鑒定質粒5μL，ddH2O 3μL，37℃保溫2h，選擇酶切鑒定確認誘變成功的質粒送上海生工生物技術服務有限公司測序。

1.4 細胞培養(yǎng) HEK293T細胞可傳代培養(yǎng)，完全培養(yǎng)液為DMEM＋10%（體積比）新生牛血清＋青霉素，每3d換液1次，5～6d傳代1次。

1.5 Western blotting法檢測EMMPRIN蛋白表達 細胞裂解后經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠電泳結束后，聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）在100%甲醇中浸泡30s以上、重蒸餾水浸泡1min，取出后放入電轉緩沖液中。凝膠與PVDF膜一起按照電轉儀裝置說明書要求安裝，形成“三明治”結構，放入電泳槽中，加電轉液，在100V電壓下轉膜。轉膜結束后，用TBST配制的5%（W／V）的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1h。然后加入用脫脂奶粉稀釋的一抗，4℃下孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。以HRP標記二抗室溫下孵育，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。在暗室中曝光，顯影，定影。

1.6 細胞免疫熒光實驗 取對數(shù)生長期的細胞以20%～30%的密度鋪到12孔板中，將其培養(yǎng)于37℃、95%濕度和5%CO2孵箱中，將提取的純度較高的質粒用OPTI－MEM轉染到細胞中。48h后熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.7 MTT法檢測細胞增殖 HEK293T細胞以4×10－3／孔的密度接種到96孔板（每孔100μL培養(yǎng)基），設對照組和實驗組，37℃、5%CO2溫箱內常規(guī)培養(yǎng)24h后應用Lipofectamine 2000轉染，每種轉染設6個平行孔。37℃、5%CO2溫箱內常規(guī)培養(yǎng)。24、48、72和96h后分別加入MTT溶液（5g·L－1）10μL，37℃、5%CO2溫箱內繼續(xù)培養(yǎng)，4h后每孔再加150μL DMSO，在酶標儀上490nm波長處測定其吸光度（A）值。A值可間接反應細胞數(shù)量，用以檢測細胞活性。對照組細胞生存率為100%，其余各組細胞生存率＝（各實驗組A值／對照組A值）×100%，相同實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞存活率以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 酶切鑒定 構建3個糖基化單點突變質粒EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）后，酶切鑒定其是否突變成功，結果顯示：BamHⅠ單酶切后，糖基化單點突變質粒不破壞酶切位點，野生型與突變型均得到7500和800bp的片段。酶切結果見圖1。

圖1 EMMPRIN突變型BamHⅠ酶切鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of identification of mutant－type EMMPRIN digested by BamHⅠ

2.2 測序鑒定 測序結果顯示：第44位天冬酰胺（AAT）突變成谷氨酰胺（CAG），第152位天冬酰胺（AAC）突變成谷氨酰胺（CAG），第186位天冬酰胺（AAC）突變成谷氨酰胺（CAG），成功構建EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）糖基化位點突變質粒，證實突變成功。測序結果見圖2（插頁四）。

2.3 Western blotting法檢測蛋白表達 將EMMPRIN以及其3個糖基化位點突變質粒分別轉入HEK293T細胞中，檢測EMMPRIN蛋白表達，結果顯示：EMMPRIN糖基化位點突變后，EMMPRIN蛋白的對應位置不能糖基化，只表現(xiàn)為非糖基化形式。見圖3。

圖3 EMMPRIN野生型與突變型蛋白的表達Fig.3 Expressions of wild－type and mutant－type EMMPRIN proteins

2.4 免疫熒光檢測細胞形態(tài)學變化 將EMMPRIN及其糖基化突變的重組質粒轉染進入HEK293T細胞中，發(fā)現(xiàn)突變后的重組質粒均可在細胞中表達，EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞核分裂相顯著減少，偽足數(shù)目減少，胞漿外有一些顆粒滯留。見圖4（插頁五）。

2.5 MTT法檢測細胞增殖 野生型細胞存活率顯著高于對照組（P＜0.05）；而EMMPRIN糖基化位點突變后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）細胞存活率均顯著低于野生型（P＜0.05）。見表1。

表1 EMMPRIN野生型與突變型不同時間點的細胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

表1 EMMPRIN野生型與突變型不同時間點的細胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

＊P＜0.05compared with vector；△P＜0.05compared with wild－type EMMPRIN.

Plasmid±4.515297.017±11.258 Wild type EMMPRIN 112.664±7.364＊132.709±7.385＊204.684±5.100＊339.433±12.229＊EMMPRIN（N44Q）89.465±0.263△101.116±2.668△160.879±1.283△288.349±14.131△EMMPRIN（N152Q）75.112±3.372△84.364±2.319△129.655±0.597△251.268±1.992△EMMPRIN（N186Q）65.399±3.127△68.047±1.272△102.075±0.623△195.535±2.87724487296 Vector 100.000±0.586114.223±1.857173.729 Survival rate（t／h）△

3 討 論

EMMPRIN是一種跨膜糖蛋白，并具有酪氨酸蛋白激酶活性，屬于免疫球蛋白超家族，參與細胞間的識別。EMMPRIN在體內分布非常廣泛，Chen等［8］觀察高鈣培養(yǎng)和EMMPRIN抗體對正常人角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞分化相關形態(tài)學，認為EMMPRIN是一種新的低分化角質形成細胞標志蛋白，并可抑制角質形成細胞的分化。EMMPRIN在多種正常上皮細胞表達，但表達水平較低［9］。EMMPRIN的表達水平與腫瘤進展關系密切，其高表達代表腫瘤的惡性進展和高死亡率，并預測不良預后［10－11］。EMMPRIN的超表達還與腫瘤耐藥性和腫瘤根治術后的復發(fā)密切相關［12］；所以EMMPRIN是診斷腫瘤和預后檢測的標志物。EMMPRIN有3個預測的糖基化位點，分別是44、152和186位的天冬酰胺。本研究通過定點突變技術將3個天冬酰胺分別突變成谷氨酰胺，構建N44Q、N152Q和N186Q單點突變EMMPRIN質粒，研究EMMPRIN的糖基化位點與腫瘤信號轉導的相關性。

EMMPRIN是一種高度糖基化的糖蛋白，其糖基化程度對蛋白穩(wěn)定性和功能方面具有重要的影響。EMMPRIN糖基化與其生物學功能的發(fā)揮密切相關，在不同轉移潛能的腫瘤細胞中EMMPRIN的糖基化形式及糖鏈結構不盡相同，腫瘤細胞表面糖基化異常與腫瘤的侵襲和轉移能力有密切關系。將突變質粒分別轉入HEK293T細胞中使其表達蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)：3個糖基化位點單點突變后，EMMPRIN蛋白不能糖基化，只表現(xiàn)為非糖基化形式，說明突變后的EMMPRIN蛋白失去了糖基化的修飾作用；同時，免疫熒光實驗結果顯示：糖基化位點突變后，其細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細胞核分裂相減少，偽足生成數(shù)減少，胞漿外顆粒滯留，可能是糖基化位點突變后，導致細胞外基質無法上膜，不能參與信號轉導過程。本研究揭示EMMPRIN的去糖基化可能調控腫瘤細胞信號轉導的開關，但信號轉導如何被開啟，尚需要深入研究。

蛋白質糖基化的分子機制對于癌癥等重大疾病的研究具有相當重要的指導意義，已成為生物學研究領域中的熱點。EMMRPIN表達水平與腫瘤進展密切相關，MTT結果進一步證實：野生型細胞存活率顯著高于對照組；而EMMPRIN糖基化位點突變后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）細胞存活率均顯著低于野生型。EMMPRIN突變型可抑制腫瘤細胞的增殖，且隨作用時間增加，其抑制作用減弱，EMMPRIN糖基化修飾與腫瘤細胞的增殖有關聯(lián)。本研究結果為深入研究EMMPRIN在腫瘤細胞中如何發(fā)揮作用及其糖基化與腫瘤的何種信號通路相關提供了線索和依據(jù)。

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