Nodal蛋白與惡性腫瘤的研究進(jìn)展

朱宗恒（長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023）

黃英（黃石市愛康醫(yī)院麻醉科，湖北 黃石 435000）

朱小鵬（長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023）

張先覺（長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院泌尿外科，湖北 荊州 434020）

隨著人口老齡化及傳染性疾病的有效控制，惡性腫瘤對人類健康的危害日益突出，并有逐年升高的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計2020年新發(fā)惡性腫瘤病例數(shù)將達(dá)1500萬，現(xiàn)患病例超過3000萬，死亡病例超過1000萬，惡性腫瘤將成為全球危害最大的疾病［1］。目前大多惡性腫瘤的治療以手術(shù)治療為主，輔以放化療，但復(fù)發(fā)率較高，5年生存率較低［2－3］。如何尋找更有效的生物醫(yī)學(xué)治療途徑降低惡性腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率、提高患者生存率，已成為亟待解決的國際難題。

腫瘤血管的新生化程度可以反映腫瘤惡性程度、浸潤性及預(yù)后［4］。國內(nèi)外學(xué)者已證實多種惡性腫瘤中存在胚胎形成素Nodal蛋白的表達(dá)，并可能通過一系列信號通路促進(jìn)腫瘤血管的生成。因此關(guān)于Nodal蛋白和腫瘤血管生成特點的研究尤為重要。近年來關(guān)于抗腫瘤血管治療的研究還處于初步階段，國內(nèi)外很少有關(guān)于通過生物學(xué)方法影響Nodal蛋白的表達(dá)從而影響腫瘤血管的生成的文獻(xiàn)報道。

1 Nodal蛋白與惡性腫瘤的相關(guān)性

腫瘤干細(xì)胞理論則認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，很多細(xì)胞因子不僅調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化，同樣也調(diào)節(jié)腫瘤的生長發(fā)育［5］。其中胚胎成形素Nodal是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）β超家族成員，不僅可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞的生長和分化［6］，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的可塑性及惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性［7］，維持胚胎干細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞的分化多潛能性。最近研究發(fā)現(xiàn)Nodal還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的表型去分化，如黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等，并增加癌細(xì)胞的侵襲性及致瘤性。

β超家族成員Nodal僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、胚胎組織和人類胚胎干細(xì)胞中。目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞株中存在Nodal的表達(dá)如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、乳腺癌、睪丸癌的移植瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腺癌、膀胱腫瘤、前列腺癌等［8－9］。并且Nodal在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，因此可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

YuL等［10］和StrizziL等［11］通過實驗發(fā)現(xiàn)Nodal僅在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中高表達(dá)，伴隨其浸潤生長及惡性程度的升高，Nodal表達(dá)隨之升高。Nodal蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤發(fā)展可能呈正相關(guān)。后來周惠俊等［12］在采用免疫組化等檢測方法對50例胃癌患者標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，Nodal蛋白對胃癌的轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。李又空等［13］通過免疫組化等檢測方法證實：正常膀胱組織中均未檢測到Nodal蛋白，而17例膀胱癌組織中均存在Nodal蛋白的表達(dá)。且隨著臨床分期及病理分級的增高，Nodal蛋白的表達(dá)均逐步增強(qiáng)。采用統(tǒng)計學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Nodal蛋白表達(dá)與腫瘤組織的惡性程度存在相關(guān)性，且呈正相關(guān)。

近來Strizzi等［14］研究表明Nodal與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過Nodal抑制劑的實驗表明，Nodal抑制劑可抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Nodal可能會成為乳腺癌靶向治療的新靶點。

2 Nodal蛋白促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)展的信號通路

TGF-β/Smads信號途徑不僅調(diào)節(jié)脊髓動物胚胎發(fā)育而且對腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控同樣起重要作用［2］。在晚期惡性腫瘤中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長［15］。通過激活Smads-2/3來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。其次也可通過不依賴Smads信號通路的非經(jīng)典路徑：Nodal及相關(guān)配體結(jié)合ALK4/7s（TGF-β1的I型蛋白受體）和ActRIIB（Ⅱ型蛋白受體），引起蛋白Smad2/3的磷酸化，其使I型蛋白受體激活，同時激活的Smad2/3蛋白與Smad4蛋白結(jié)合形成受體復(fù)合物，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號進(jìn)入細(xì)胞核后，Smad4蛋白與特定轉(zhuǎn)錄因子如FoxH1等配體相互作用而調(diào)控下游基因，最終發(fā)揮其生理作用調(diào)節(jié)Nodal基因的表達(dá)［16－17］。

3 Nodal對腫瘤血管生成的促進(jìn)作用

腫瘤血管的生成可分為三個階段：腫瘤細(xì)胞相關(guān)性血管、馬賽克血管、內(nèi)皮依賴性血管。腫瘤在體積小于2mm時是無血管的緩慢生長期，多種誘發(fā)因素刺激腫瘤細(xì)胞活化并分泌多種血管生成刺激因子，活化內(nèi)皮細(xì)胞和金屬蛋白酶，導(dǎo)致基底膜及周圍的細(xì)胞外基質(zhì)降解，引起內(nèi)皮細(xì)胞的變形遷移、增生形成新生血管芽，最后血管芽彼此吻合形成新生血管。

MVD（微血管密度）為最密集腫瘤部位微小血管的平均計數(shù)，是腫瘤血管生成程度的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)MVD隨著腫瘤TNM分期的增加，MVD值相應(yīng)升高。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤中心位置微血管數(shù)量明顯低于邊緣部位，證明了微血管與腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移及分級分期關(guān)系密切。Maniotis［3］對侵襲性人葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究中發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)有血流通過，由此所形成的環(huán)袢狀血管樣管道被稱為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）。腫瘤細(xì)胞相關(guān)性血管即血管生成擬態(tài)是腫瘤早期主要的血液供應(yīng)來源［18］。VM的提出是對腫瘤血管生成理論的重要補(bǔ)充。通過血管生成擬態(tài)現(xiàn)象表明細(xì)胞分化存在可塑性，而發(fā)育中的胚胎干細(xì)胞可以分化形成腫瘤細(xì)胞，所以細(xì)胞可塑性調(diào)節(jié)因子Nodal，其表達(dá)水平降低將影響腫瘤細(xì)胞的可塑性，抑制血管生成擬態(tài)的形成［19］。

Josephine等［20］通過原位雜交試驗發(fā)現(xiàn)裸鼠移植瘤中可見網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（VM）的表達(dá)，同時Nodal也存在高表達(dá)，非腫瘤區(qū)域不表達(dá)，表明Nodal與VM形成存在相關(guān)性。Strizzi L等［21］實驗證實抑制Nodal表達(dá)將影響黑色素瘤網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（VM）的形成、導(dǎo)致細(xì)胞程序性凋亡，從而影響腫瘤的形成。不同生長微環(huán)境［22］將影響黑色素瘤細(xì)胞的惡性表型轉(zhuǎn)化，在缺氧環(huán)境中，黑色素瘤細(xì)胞能夠通過HIF-la上調(diào)VEGF、MMP-9及MMP-2等蛋白表達(dá)，此時腫瘤細(xì)胞更富有侵襲性，同時促進(jìn)腫瘤血管生成擬態(tài)的形成。有研究［23］發(fā)現(xiàn)，Nodal與乳腺癌VM的形成呈正相關(guān)，Nodal表達(dá)下調(diào)能夠抑制乳腺癌VM的形成，進(jìn)而抑制腫瘤形成。隨后的研究中均證實VM存在于雙分化腫瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌中，VM的存在與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、臨床分期等密切相關(guān)，因此Nodal可促進(jìn)腫瘤血管生成擬態(tài)的形成。

陳啟斌等［24］通過RNA干擾技術(shù)干擾人Nodal的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)人Nodal基因被干擾后表達(dá)沉默，可顯著影響肝癌細(xì)胞的生長侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，影響腫瘤血管生成擬態(tài)的形成。表明沉默Nodal的表達(dá)可以阻止腫瘤血管形成和腫瘤的生長、浸潤，從而減緩惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

4 Nodal蛋白在腫瘤血管生成中的信號通路

Dueng-YuanHueng對63例星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例切片采用免疫組化、ELISA等方法對Nodal蛋白染色，18例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHO分級Ⅳ），24例間變星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤（Ⅲ），14例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤（Ⅱ），2例癲癇患者對照標(biāo)本（Ⅰ）［25］。分析人類U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞，敲除內(nèi)源性的Nodal（通過RNA干擾技術(shù)）會減少VEGF的分泌及腫瘤血管的形成，影響腫瘤的發(fā)展。在田鼠體內(nèi)實驗中U87MG/shNodal細(xì)胞中Nodal被耗竭的情況下將嚴(yán)重抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增長并延長其生存期限。上述實驗表明抑制Nodal蛋白表達(dá)可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管的生長。進(jìn)一步實驗采用Nodal抑制劑（SB431524），在U87MG，GBM8401和GBM神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中沉默或超表達(dá)Nodal，發(fā)現(xiàn)Nodal可能通過ERK1/2—HIF-1α信號路徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，影響腫瘤血管的生成。

以上實驗數(shù)據(jù)顯示，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nodal表達(dá)水平的升高可以誘導(dǎo)VEGF的分泌，進(jìn)而引起腫瘤的生長和新生血管形成。這與Nodal通過ERK1/2-HIF-1α-VEGF信號路徑調(diào)節(jié)腫瘤血管生成相一致。

Paulis等［26］研究發(fā)現(xiàn)，Nodal蛋白的表達(dá)參與黑色素瘤血管生成的形成及腫瘤發(fā)展過程中。快速增長的早期黑色素瘤組織需要更多的血液供應(yīng)，并引起組織缺氧，進(jìn)而刺激HIF1-a的表達(dá)，其活化血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），進(jìn)而誘導(dǎo)VM網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成。與此同時，HIF-a信號進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Notch所在區(qū)域，其被活化后，導(dǎo)致Notch成分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并活化轉(zhuǎn)錄Nodal。接著Nodal以分泌方式在黑色素瘤細(xì)胞中得以表達(dá)。黑色素瘤細(xì)胞信號相互作用以Nodal自分泌的方式得以繼續(xù)。維持著黑色素瘤可以處于一種繼續(xù)引起內(nèi)皮細(xì)胞分化和VM形成的循環(huán)模式。其中Nodal/Notch通路是VM的形成中的重要途徑。

轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中Nodal蛋白與微血管密度（MVD）存在相關(guān)性［27］。在體內(nèi)它促進(jìn)血管聚集，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)Nodal促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即血管生成擬態(tài)的形成，并調(diào)節(jié)VEGF在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。另有研究表明ShRNA可以發(fā)現(xiàn)Nodal可以定向作用于目標(biāo)腫瘤，導(dǎo)致腫瘤血管密度的降低和誘導(dǎo)腫瘤組織壞死［28］。

Nodal信號途徑的調(diào)節(jié)是通過細(xì)胞外的EGF-CFC因子來完成的［29］。無論關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管生成中的Nodal/VEGF/血管生成信號途徑還是黑色素瘤血管生成擬態(tài)中的Nodal/VEGF/VM信號途徑，在血管生成過程中VEGF均參與了腫瘤血管生成的過程，且非常關(guān)鍵。這與VEGF已證實是腫瘤血管生成中作用最明顯、特異性最高的因子，其可以調(diào)控腫瘤血管生成的各個環(huán)節(jié)的理論相一致。Nodal在神經(jīng)膠質(zhì)和惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性乳腺癌中均通過一系列信號通路促進(jìn)VEGF的分泌，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成。

綜上所述，Nodal蛋白促進(jìn)惡性腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展。

5 展望

目前很少有關(guān)于Nodal蛋白促進(jìn)惡性腫瘤血管生成的相關(guān)性研究。在今后的研究中，我們希望進(jìn)一步探討Nodal蛋白通過何種機(jī)制促進(jìn)VEGF分泌進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤血管生成，明確中間關(guān)鍵因子VEGF在Nodal蛋白促進(jìn)惡性腫瘤血管生成中是否為必要條件，為抗惡性腫瘤血管生成治療提供新的方向，降低惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，提高患者生存率。

［1］楊玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計和預(yù)測 ［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)訓(xùn)計，2005，22（4）：218-221.

［2］Li Y，Yang K，Mao Q，et al.Inhibition of TGF-beta receptor I by siRNA suppresses the motility and invasiveness of T2-T4bladder cancer cells via modulation of integrins and matrix metalloproteinase ［J］.Int Urol Nephrol，2010，42（1）：315-323.

［3］Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al.Vascular channel Formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry ［J］.Am J Pathol，1999，155：739-752.

［4］Li C，Guo B，Bernabeu C，et al.Angiogenesis in breast cancer：the role of transforming growth factor beta and CD105［J］.Microsc Res Tech，2001，52（4）：437-449.

［5］Htunfly BJ，Gilliland D.Cancerbiology：summingupcance stem cell［J］.Nature，2005，435（7046）：1169-1170.

［6］Mflpou JK，chen B，Sui L，et al.Recent advances and prospects in the differentiation of pancreatic cells from human embryonic stem cells ［J］.Diabetes，2010，59（9）：2094-2101.

［7］Kaminska B，Wesolowska A，Danilkiewicz M.TGF beta signalling and its role in tumour pathogenesis ［J］.Acta Biochim ，2005，l52：329–337.

［8］Monteiro J，F(xiàn)odde R.Cancerstemnessandmetastasis：therapeuticconsequences and perspectives ［J］.Eur J Cancer，2010，46（7）：1198-1203.

［9］Kulesa PM，Kasemeier-Kulesa JC，Teedy JM，et al.Reprogramming meastatic melanoma cells to assume a neural creat like phenotype in an embryonic micronenvironment［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（10）：3752-3757.

［10］Yu L，Harms PW，Pouryazdanparast P，et al.Expression of the embryonic morphgen Nodal in cutaneous melanocytic lesions［J］.Mod Pathol，2010，23（9）：1209-1214.

［11］Giatromanolak A，Bai M，Margaritis D，et al，Hypoxia and activated VEGF/receptor pathway in mulptiple myeloma［J］.Anticancer Res，2010，30（7）：2831-2836.

［12］周慧俊，鐘美佐.Nodal蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)及意義 ［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（25）：35-36.

［13］李又空，周家杰，張先覺，等.膀胱移行細(xì)胞癌組織中Nodal的表達(dá) ［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（36）：11-13.

［14］Strizzi L，Postovit LM，Margaryan NV，et al.Emerging Roles of Nodal and Cripto-1：From Embryogenesis to Breast Cancer Progression ［J］.Breast Dis，2008，29：91-103.

［15］Wakefield LM，Roberts AB.TGF-beta singnaling：positive and negative effects on tumorigenesis ［J］.Curr Opin Genet Dev，2012，12（1）：22-29.

［16］Germain S，Howell M，Esslemont GM，et al.Homeodomain and winged-helix transcription factors recruit activated Smads to distinct promoter elements via a common Smad interaction motif［J］.Genes Dev，2000，14（4）：435-451.

［17］Randall RA，Howell M，Page CS，et al.Recongnition of phosphorylated-Smad2-containing complexes by a novel Smad interaction motif［J］.Mol Cell Biol，2004，24（3）：1106-1121.

［18］Zhang S，Guo H，Zhang D，et al.Microcirculation patterns in different stages of melanoma growth ［J］.Oncol Rep，2003，15：15-20.

［19］Strizzi L，Postovit LM，Margaryan NV，et al.Nodal as a biomarker for melanoma progression and a new therapeutic target for clinical intervention ［J］.Expert Rev Dermatol，2009，4（1）：67-78.

［20］Josephine C，Allister QZ，Carste W，et al.The embryonic morphogen，Nodal，is associated with channel-like structures in human malignant melanoma xenografts ［J］.J Cutan Pathol，2010，37（1）：19-25.

［21］Strizzi L，Postovit LM，Margaryan NV，et al.Emerging Roles of Nodal and Cripto-1：From Embryogenesis to Breast Cancer Progression ［J］.Breast Dis，2008，29：91-103.

［22］張丹芳，張詩武，孫保存，等.缺血缺氧對黑色素瘤局部浸潤的相關(guān)分子機(jī)制影響的初步研究 ［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14（06）：40-404.

［23］Quail DF，Walsh LA，Zhang G，et al.Embryonic protein nodal promotes breastcancervascularization ［J］.CancerRes，2012，72（15）：3851-3863.

［24］陳啟斌，莢衛(wèi)東，許戈良，等.Nodal基因干擾對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為及血管生成擬態(tài)的影響 ［J］.中華普通外科雜志，2012，27（2）：119-122.

［25］Hueng Duengyuan.Inhibition of Nodal suppresses angiogenesis and growth of human gliomas［J］.Neurooncol，2011，104：21-31.

［26］Paulis YW，Soetekouw PM，verheul HM，et al.Signallingpathwaysinvasculogenicmimicry ［J］.BiochimBiophysAca，2010，1806（1）：18-28.

［27］Daniela F.Quail embryonic protein Nodal promotes breast cancervascularization ［J］.CanceTumorand Stem Cell Biology Research，2012，72（15）：3851-3861.

［28］Calvo Alvo A，Caterna R，Noble MS，et al.Identification of VEGF-regulated genes associated with increased lung metastatic potential：functional involvement of tenascin-C in tumor growth and lung metasis［J］.Oncogene，2008，27（40）：5373-5384.

［29］Alexander F，Michael M，Shen S.Nodal Signaling lnve-rte Brate Development［J］.Nature，2007，403（27）：385-389.

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