二次通用旋轉組合設計優化紫菜粗多糖的提取

郭 萌，謝三都，葉麗淑

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二次通用旋轉組合設計優化紫菜粗多糖的提取

郭 萌1，謝三都2，葉麗淑2

(1.漳州職業技術學院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000;2.福建師范大學閩南科技學院 生命科學與化學系，福建 泉州 362332)

采用復合酶法，在單因素基礎上，通過二次通用旋轉組合設計優化紫菜粗多糖（Crude Polysaccharide from，CPP）提取工藝條件。結果表明，紫菜粗多糖的最佳提取工藝條件為：料液比（mg/mL）1︰40、pH4.0，添加含5%纖維素酶和5%果膠酶的復合酶，65℃恒溫酶解150min（纖維素酶30min、果膠酶120min），所得紫菜粗多糖提取率為4.78%。

紫菜；粗多糖；纖維素酶；果膠酶；二次通用旋轉組合設計

紫菜（）屬紅藻類、紫菜屬，素有“巖礁嬌子”之稱[1]。現代營養學研究發現，干紫菜中含蛋白質、碳水化合物、維生素等大量的營養物質[2][3]，具有極高的營養保健價值。目前，我國紫菜加工總體水平低下，紫菜制品主要有紫菜餅、紫菜片等粗加工紫菜食品[4]，產品的附加值較低。

多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，是一類有醛糖和（或）酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然大分子。紫菜多糖（Polysaccharide from，PP）屬半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3，6-內醚半乳糖和硫酸基等組成，占紫菜干質量的20％-40％，是紫菜的主要成分之一[5]。現代醫學研究發現，紫菜多糖具有抗凝血等多重生物學活性[6-8]。從紫菜中提取紫菜多糖成為開拓紫菜精深加工的新的途徑之一。

本文以紫菜粗多糖提取率為指標，采用苯酚-硫酸法測定，在單因素實驗基礎上，采用二次通用旋轉組合設計優化了纖維素酶復合果膠酶提取紫菜粗多糖的提取工藝條件，為紫菜多糖的工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：紫菜，購于超市。

試劑：纖維素酶：2000U/g、果膠酶：30000U/g，均由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供；D-葡萄糖，苯酚，濃硫酸，碳酸鈉，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JSP-100型高速多功能粉碎機：浙江省金德機械制造廠；雷磁pHS-3C pH計：上海精密科學儀器有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋：江蘇省榮華儀器制造有限公司；臺式離心機TDL-40B：上海安亭科學儀器廠；UV755B型紫外可見分光光度計：上海佑科儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1紫菜粗多糖提取工藝流程

紫菜→烘干→粉碎→40目過篩→復合酶提取→滅酶（90℃，15min）→粗慮→離心分離（4000r/min，10min）→干燥→紫菜粗多糖。

1.3.2紫菜粗多糖含量的測定

1.3.2.1標準曲線的繪制

參照謝三都[9]等關于植物多糖的測定方法，以葡萄糖為標準樣，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，所得標準曲線如圖1所示，所得標準曲線方程為：Y=0.0022X+0.0232，R2=0.9993，其中，X表示葡萄糖溶液濃度，單位μg/mL，Y表示吸光度OD490nm，該方程表明在0-40μg/mL范圍內，葡萄糖溶液濃度與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.3.2紫菜粗多糖含量的測定

準確稱取2.5g紫菜粉，復合酶提取獲得紫菜粗多糖溶液，按1.3.2.1方法中葡萄糖標準溶液配制中的步驟操作，以試劑空白做參照，測定其吸光度。用標準曲線計算紫菜粗多糖提取率。

式中，X為樣液的濃度（μg/mL），V為樣液體積（mL），M為紫菜質量（μg）。

1.3.3單因素實驗

1.3.3.1 不同料液比對紫菜粗多糖提取率的影響

將紫菜粉末按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60的料液比配制，先分別加入3%纖維素酶50℃恒溫酶解15min，再分別加入4%果膠酶50℃恒溫酶解2h后，過濾、離心分離，測定濾液中紫菜多糖含量，研究不同料液比對紫菜粗多糖提取率的影響。

1.3.3.2不同pH對紫菜粗多糖提取率的影響

將紫菜粉末按1:40的料液比配制，調整pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，加入3%纖維素酶50℃恒溫酶解15min，再加入4%果膠酶50℃恒溫酶解2h后，過濾、離心分離，測定濾液中紫菜多糖含量，研究不同pH對紫菜粗多糖提取率的影響。

1.3.3.3時間對紫菜粗多糖提取率的影響

將紫菜粉末按1:40的料液比配制，調整pH5.0，先加入3%纖維素酶50℃恒溫酶解10、15、20、25、30min，再加入4%果膠酶50℃恒溫酶解60、75、90、105、120min后，過濾、離心分離，測定濾液中紫菜多糖含量，研究不同時間對紫菜粗多糖提取率的影響。

1.3.3.4溫度對紫菜粗多糖提取率的影響

將紫菜粉末按1:40的料液比配制，調整pH5.0，加入3%纖維素酶于45、50、55、60、65℃恒溫酶解15min，再加入4%果膠酶于相同溫度條件下恒溫酶解2h后，過濾、離心分離，測定濾液中紫菜多糖含量，研究不同溫度對紫菜粗多糖提取率的影響。

1.3.3.5復合酶添加量對紫菜粗多糖提取率的影響

將紫菜粉末按1:40的料液比配制，調整pH5.0，分別加入1、2、3、4、5%纖維素酶于50℃恒溫酶解15min，再加入相同質量的果膠酶50℃恒溫酶解2h后，過濾、離心分離，測定濾液中紫菜多糖含量，研究不同復合酶添加量對紫菜粗多糖提取率的影響。

1.3.4二次通用旋轉組合試驗設計

在單因素實驗的基礎上，分別將pH值、時間、溫度、酶添加量對紫菜粗多糖提取率的影響，采用DPS數據處理系統設計四因素五水平二次通用旋轉組合試驗設計，如表1所示，試驗結果分析均在DPS數據處理軟件下運行。

表1 因素水平編碼表

1.4 數據處理

應用DPS數據處理軟件，對二次通用旋轉組合設計試驗結果的數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同料液比對紫菜粗多糖提取率的影響

圖2 不同料液比對紫菜粗多糖提取率的影響

如圖2所示，隨著料液比的增加，紫菜粗多糖提取率逐漸增大；當料液比增加至1:40時，紫菜粗多糖提取率為1.426%；繼續增加料液比，紫菜粗多糖提取略有下降。因此，料液比選1:40為宜。

2.2 不同pH對紫菜粗多糖提取率的影響

圖3 不同pH對紫菜粗多糖提取率的影響

pH是酶促反應的主要條件之一。由圖3可知，在pH值為4.5時，紫菜粗多糖提取率達到最大值。本反應體系下，復合酶水解的適宜pH為4.5。

2.3 不同提取時間對紫菜粗多糖提取率的影響

圖4 不同提取時間對紫菜粗多糖提取率的影響

酶促反應隨時間延長，酶解的效果增加。由圖4可知，復合酶反應的最佳時間是纖維素酶水解20min，果膠酶水解90min，在此反應時間下，紫菜粗多糖提取率達到1.81%。

2.4 不同提取溫度對紫菜粗多糖提取率的影響

圖5 提取溫度對紫菜粗多糖提取率的影響

溫度是影響酶促反應速度的最主要因素之一。在適宜溫度條件下，酶促反應速度達到最大值，此時酶解的效果最佳。由圖5可知，復合酶反應的最適溫度是55℃，此反應溫度下，酶解速率最大，紫菜粗多糖提取率最高為2.1%。

2.5 復合酶添加量對紫菜粗多糖提取率的影響

圖6 復合酶添加量對紫菜粗多糖提取率的影響

由圖6可知，復合酶添加量為2%-8%時，隨著酶添加量的增加紫菜粗多糖提取率顯著增加；當酶添加量為8%時，紫菜粗多糖提取率達到最大；當酶添加量超過8%時對紫菜粗多糖提取率影響很小。因此，8%為酶解的最佳酶添加量。

2.6 二次通用旋轉組合設計結果

2.6.1數學模型的建立與檢驗

二次通用旋轉試驗方案及試驗結果見表2。

表2 二次通用旋轉組合試驗設計及結果

利用DPS軟件對試驗結果進行分析，得到二次回歸模型為：

Y=1.9-0.1475X1-0.07417X2-0.02333X3+0.285X4-0.06104X12-0.16229X22+0.00146X32-0.09229X42-0.0375X1X2-0.265X1X3+0.18875X1X4+0.42125X2X3-0.005X2X4+0.1675X3X4

根據試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3 試驗結果方差分析表

從表3知，失擬F1=1.794＜F0.05（10，6）=4.06，P=0.14331＞0.05，擬合不足是不顯著的；回歸F2=3.840＞F0.01（14，16）=3.45，P=0.00763，回歸呈極顯著，因此說明該模型擬合度較好。對模型中各項系數進行檢驗，在α=0.01顯著水平剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程為：

Y=1.9-0.1475X1+0.285X4-0.16229X22-0.265X1X3+0.18875X1X4+0.42125X2X3+0.1675X3X4。

最高值的各個因素組合：X1=－2、X2 =2、X3=2、X4=2，此時Ymax=4.78%。

即最優工藝條件是：復合酶水解pH值4.0，水解時間150min（其中纖維素酶水解時間30min、果膠酶水解時間120min），水解溫度65℃，復合酶添加量10%。

2.6.2數學模型的應用分析

2.6.2.1單因子效應分析

將四因素中的三個固定在零水平，對數學模型進行降維分析，得到以其中一個因素為決策變量的偏回歸模型，如圖7所示。

圖7 各試驗水平對紫菜粗多糖提取率的影響

由圖7可知，pH值4.0-6.0，時間70-120min，溫度45-65℃，X4（復合酶添加量）對紫菜粗多糖提取率的影響最大，其次分別是X3（溫度）、X1（pH）、X2（時間），各因素的變化趨勢與所做的單因素分析相一致。

2.6.2.2因素協同作用分析

由表3可知，回歸方程中只有X1X3和X2X3影響達到極顯著（P=0.00511＜0.1，P=0.000＜0.1），因此對X1X3和X2X3的交互作用進行響應曲面分析。

圖8 pH值和溫度對紫菜粗多糖提取率的影響

圖9 時間和溫度對紫菜粗多糖提取率的影響

由圖8可以看出，pH值4.0～4.75范圍內，隨著溫度的升高，紫菜粗多糖提取率呈下降趨勢；而當pH值在5.25～6.5范圍內，隨著溫度的升高，紫菜粗多糖提取率呈上升趨勢。在pH值為6、溫度為65℃時，紫菜粗多糖提取率達到最大值3.255%。

由圖9可以看出，溫度在45-47.5℃范圍內，隨著時間的增加，紫菜粗多糖提取率增加；當溫度在47.5-60℃范圍內，紫菜粗多糖提取率隨時間增加呈先增加后減少的趨勢；當溫度在60-65℃范圍內，隨時間增加，紫菜粗多糖提取率下降。在溫度為45℃、復合酶解時間為65min和溫度為65℃、復合酶解時間為70min時，紫菜粗多糖提取率均達到最大值2.9358%。

3 結 論

在單因素實驗的基礎上，通過二次通用旋轉組合設計優化了復合酶法提取紫菜粗多糖的提取工藝條件為：在料液比為1:40、pH 4.0的條件下，添加含5%纖維素酶和5%果膠酶的復合酶，65℃恒溫酶解150min（纖維素酶30min、果膠酶120min），所得紫菜粗多糖提取率為4.78%。

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[8] 周慧萍，陳瓊華．紫菜多糖對實驗性血栓和心肌收縮力的影響[J]．中國醫科大學學報，1991，22(1)：50-52．

[9] 謝三都，熊榮華．響應面法優化金銀花水溶性多糖提取工藝條件[J]．農產品加工學刊，2013（1）：38-41．

（責任編輯：季平）

Optimization of Extraction Process of Porphyra Crude Polysaccharides by Quadratic General Rotary Unitized Design

GUO Meng1, XIE San-du2, YE Li-shu2

(1. Department of Food and Biological Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Fuzhou Zhangzhou,363000, China; 2. Department of Chemistry and Life Science, Minnan science and Technology Institute, Fujian Normal University, Fujian Quanzhou, 362332, China)

With multiple enzyme method, the extraction conditions of crude polysaccharide from(CPP) were optimized by the quadratic general rotary unitized design based on single factor. The result show that the optimum extraction conditions for CPP are as follow: 1∶40 solid-liquid ratio (mg/mL), added compound enzyme consisting of 5% cellulase for 30min and 5% pectinase for 120min at the condition of 65℃ and pH4.0. Under these conditions, the extraction rate of CPP was 4.78%.

Porphyra yezoensis; crude polysaccharide; cellulase; pectinase; quadratic general rotary unitized design

2014－04－10

郭 萌（1984－），女，湖北襄陽人，助教，本科，主要從事食品科學的教學及科研工作。

1673-1417（2014）02-0008-07

10.13908/j.cnki.issn1673-1417.2014.02.0002

TQ464.1

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