腎小球電荷屏障研究的新進展

潘錫正(綜述)，林 芳(審校)

(1.桂林醫學院，廣西 桂林541001； 2.桂林市第二人民醫院內分泌科，廣西 桂林541001)

腎小球濾過是腎臟完成各種代謝產物排泄的主要形式，腎小球濾過膜損傷被普遍認為是導致腎病綜合征，甚至是終末期腎衰竭的重要原因。美國2012年度腎臟病數據系統報告，終末期腎衰竭患者達594 374例，醫療費用占總醫療保險支出的6.3%[1]；中國的終末期腎衰竭登記尚不完整，Zhang等[2]根據相關參數推測，在未來的10年中國終末期腎衰竭患者將達到650例/百萬人口，腎臟替代治療花費將占國家醫藥費用的10%。腎小球濾過屏障進展機制的了解對于解決腎臟疾病相關問題很有必要。

1 腎小球濾過膜屏障模型構成

經典的腎小球濾過屏障模型從里向外由三層構成。內層是毛細血管的內皮細胞。內皮細胞上有許多直徑為60～100 nm的小孔，是白蛋白分子直徑(3.6 nm)的15倍以上，稱為窗孔[3]。中層是非細胞性的基膜，呈微纖維網狀結構。基膜上有直徑為2～8 nm的多角形網孔，是腎小球防止大分子蛋白質濾過的主要屏障。外層是腎小球的上皮細胞。上皮細胞具有足突，相互交錯的足突之間形成裂隙。裂隙上有一層濾過裂隙隔膜，膜上有直徑為4～14 nm的孔，是濾過的最后一道屏障[4]。濾過膜的電荷可由其表面的化學基團的解離、化學鍵、電解質溶液中物理吸附的離子所決定。腎小球濾過膜上的孔徑大小決定了其分子屏障，一般來說，分子有效半徑<2.0 nm的中性物質可自由濾過，有效半徑>4.2 nm的物質則不能濾過，有效半徑在2.0～4.2 nm之間的各種物質隨有效半徑的增加，其濾過量逐漸減少。Bohrer等[5]用不同帶電荷的右旋糖酐進行實驗觀察到，即使有效半徑相同，由于其帶不同電荷導致右旋糖酐的清除率呈現指數級的升降變化，表明濾過膜電荷屏障在決定濾過物質通透性方面具有重要作用。

2 流動電位理論

2.1流動電位理論的提出 Hausmann等[6]提出了流動電位影響腎小球濾過屏障的通透性，他們用顯微穿刺術，在兩棲動物斑泥螈腎臟內直接測量到濾液穿過腎小球濾過膜時產生的電場，這個電場在腎小囊內為負，在腎臟毛細血管腔內為正，且與腎小球濾過壓成正比，其測量的平均值為每-0.045 mV/10 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)有效濾過壓，在正常人體，靠近入球小動脈端有效濾過壓約為10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，出球小動脈端有效濾過壓接近0 mm Hg，平均有效濾過壓約為5 mm Hg，則推測其電位差的范圍為0.1～0.5 mV，假如腎小球濾過膜厚度為600 nm，那么跨過腎小球濾過膜的場強可達到800 V/m。Hausmann等[6]提出了濾過壓相關的電場產生的機制，即流動電位。因此，推測小的陰離子(如Cl-、HCO3-等)相對于陽離子(如Na+、K+等)更多地聚集在腎小囊內，從而產生了一個在腎小球囊內為負的電場。

2.2流動電位的產生機制 流動電位是液體沿著帶電的微血管或者孔徑切線運動時，帶電荷粒子由于受到滑面電位(zeta電位)的影響，導致下游電荷積累，在上下游之間產生電位差，即產生流動電位[7]。結合斯特恩雙電層的理論模型(如圖1A)來進一步闡述這一機制：腎小球濾過膜主要含有負電荷，當在濾過壓作用時流體穿過狹窄的濾過通道，由于摩擦作用，在液層中部流速最大，而濾過膜孔壁處流速為0，因此存在一個固定液相與流動液相之間的分界面，稱為滑移面；滑移面以內是濾過膜靜電引力作用下緊緊吸附的陽離子構成的斯特恩層(即固定層)，實質上是一個位移界面，該界面上的電位稱為界面動電位，或者稱zeta電位，其導致擴散層(即可移動層)中特定區域內(如圖A中a區)帶電離子的分布不均一，主要表現為正電荷的離子多于負電荷離子，其電位的影響隨著離濾過膜表面的距離增加而減弱，在電位為0的部位正負離子的濃度相同，液體流動時靠近濾過膜表面的雙電層中的擴散層將帶著更多的正電荷離子一起向濾過膜的另一端流動，這樣就出現了電流，這種因流體流動而引發的電流稱為流動電流,其在濾過膜孔隙兩端產生的電位差則稱為流動電位[8-10]。

上述雙電層理論模型預測的濾過膜產生了動電效應，在離子流的末端即腎小囊內為正電荷離子聚集，與Hausmann等[6]實驗觀察到的動電效應模型相反。

Delgado等[7]認為，任何帶電濾過膜的具體電性質均由其周圍的離子空間分布所決定，且將斯特恩層中被吸附離子分成普通離子和特定吸附離子。普通離子僅通過靜電引力吸附，特定吸附的離子(通常是二價離子)具有除了靜電引力之外附加的化學的或者特有的表面吸附力。這種特定吸附的離子可能導致濾過膜過分充電而表現為帶正電荷的效應，這將會改變滑動面電位，顛倒zeta電位的極性，從而改變腎小球濾過膜上擴散層電荷分布(如圖1B)。結果使更多的陰離子在濾過膜孔隙另一端為聚集，即形成腎小球囊內為負，在腎臟毛細血管腔內為正的電場。可見，在上述斑泥螈的腎小球濾過膜過度吸附而顛倒zeta電位發揮了重要作用。

圖1 斯特恩雙電層理論模型[11]

2.3腎小球流動電位的功能 最接近腎小球濾過膜的是持續靜-靜脈血液濾過，且已被廣泛用于終末腎病患者的替代治療。任何持續靜-靜脈血液濾過最終會被堵塞，但是腎小球濾過膜在生理情況下從沒有顯示出任何堵塞的跡象。在持續靜-靜脈血液濾過系統，僅考慮了對流和擴散兩種力量的影響[12]。

Akilesh等[13]的實驗觀察到腎小球足細胞是內吞活躍細胞，具有清除濾過膜功能。人類的腎臟每日從血漿中濾過180 L的原尿，假設腎小球濾過面積是1 m2，約10 kg/m2的蛋白被從腎小球濾過膜移走。阻塞在濾過膜中的分子會迅速被足細胞，甚至是內皮細胞、系膜細胞所吞噬。研究表明內皮細胞層厚度為200～400 nm，然而假設細胞層(內皮細胞、足細胞，不包括腎小球基膜) 總共厚約600 nm，濾過膜面積1 m2，約600 mg/m2細胞(內皮細胞和足細胞)，假如它們每日最多能處理其自身容積的蛋白，總量仍少于總共濾過負荷的0.006%[14]。這對于清除血漿蛋白的溶液是不足夠的。許多研究中將濾過膜看成是一個凝膠，產生一個跨越類似凝膠的濾過膜的電場對于避免濾過膜堵塞是一個簡單且有效的解決方案[15-16]。因為血漿中大分子往往產生固定的負電荷,近中性、正電荷的大分子生理情況下在血漿中很少存在，因此大分子陰離子穿過濾過膜時受電場影響回到血液中。

Ciarimboli等[17]用含白蛋白的灌注液在離體小鼠腎臟的實驗，從三個不同方面證明動電效應在腎小球濾過中的重要性，其一，用不同pH(4.0、5.3、7.4、8.75)的灌注液進行實驗時，觀察到白蛋白的濾過系數隨著灌注液的pH增加而減少，其原因是白蛋白在其等電點(isoelectric point PI 4-5)附近，即pH=4.0時，所帶凈電荷趨于0，呈電中性，因此白蛋白受跨過濾過膜的電場影響最小，白蛋白的濾過系數最大，當其升高灌注液的pH時，白蛋白所帶負電荷不斷增加，受跨過濾過膜的電場影響逐漸增加，則白蛋白的濾過系數逐漸減小；其二，用魚精蛋白去中和腎小球濾過膜上的負電荷觀察到白蛋白的通透性增加；其三，用陽離子化的方法使白蛋白帶正電荷，觀察到白蛋白的通透性亦增加。

Rennke等[18]用追蹤法在離體灌注的小鼠腎臟中電鏡下觀察帶有不同電荷的鐵蛋白(等電點為6～8)被阻止情況，當用帶負電荷的鐵蛋白時，觀察到其大部分被阻止在腎小球濾過膜的內皮細胞和基膜層；當用帶中性電的鐵蛋白時，較多的鐵蛋白進入濾過膜，被阻止在腎小球基膜和裂隙膈膜層；當用帶正電荷的鐵蛋白時(等電點>8.8)，鐵蛋白被吸附到帶負電荷的內皮多糖上，此外相對最多的帶正電荷的鐵蛋白阻止在濾液中。從以上實驗中可以得出三個結論：①內皮細胞和它的多糖不太可能起到主要的機械屏障作用，因為內皮細胞窗孔為白蛋白分子直徑的15倍以上，最可能的阻止負電荷鐵蛋白進入濾過膜的是電場[1]；②當電荷效應不存在時，腎小球基膜和裂隙膈膜相當于一個被動的濾過膜的大小選擇器(從中性鐵蛋白中可以觀察到)；③阻止和聚集在濾液中最多的是帶正電荷的鐵蛋白，其原因是：帶正電鐵蛋白改變了電泳方向，與對流和擴散起到了協同作用，從而使正電鐵蛋白更容易通過濾過液，更少被阻止，反而導致鐵蛋白堵塞了濾過膜，大量的鐵蛋白被阻止進入到濾過膜。這些發現再次證明了跨過濾過膜電場的重要性。

2.4腎小球靜電作用力與流動電位的區別與聯系 腎小球靜電作用力描述的是濾過膜的固定電荷對具有通透性的帶電顆粒之間的影響，腎小球靜電作用力是一個靜止的因素。流動電位描述的是液體沿著帶電的濾過膜運動時，帶電荷粒子在上下游之間產生電位差。從上述流動電位雙電層模型中可見，腎小球靜電作用力是其流動電位產生的必要條件。因此很難將兩者的效應區分開，兩者共同構成腎小球濾過的電荷屏障，當疾病損傷濾過膜上的固定電荷時，流動電位的產生亦受影響。

3 腎小球電荷屏障損傷與蛋白尿

研究證實，內皮細胞窗孔和窗孔之間存在一層多糖包被，稱為“糖萼”，由蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和血漿蛋白等物質構成，是參與維持腎小球濾過膜電荷選擇屏障的物質基礎[19]。糖尿病腎病患者內皮細胞糖萼減少，其程度與蛋白尿的形成相關[20]。另外有研究發現，降解或破壞內皮細胞糖萼，雖然基膜結構正常，但腎小球對血白蛋白的通透性顯著增加[19]。內皮細胞和它的多糖不太可能起到主要的機械屏障作用[3]。因此,內皮細胞的特殊結構糖萼是阻止血漿白蛋白濾過起到重要電荷屏障作用，其減少和結構破壞將導致蛋白尿。腎小球基膜為凝膠狀的細胞外基質，主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白以及硫酸類肝素(heparan sulfate，HS)等構成帶負電荷的電荷屏障[21]。研究發現，選擇性敲除層粘連蛋白β2基因的小鼠腎小球基膜超微結構似乎完整，但層粘連蛋白陰電荷分布異常，出生后早期即產生白蛋白尿，而后出現足突融合和裂孔膜缺失，表現為先天性腎病綜合征伴視網膜、神經肌肉接頭病變[22]。HS作為腎小球基膜中的主要帶負電荷物質，在糖尿病腎病中的含量減少導致腎小球基膜對白蛋白的通透性增加，進而發生蛋白尿[23]。

足細胞表面覆蓋有一層帶負電荷的唾液酸糖蛋白，是參與維持腎小球濾過膜電荷選擇屏障的物質基礎[24]。文獻證實，無論1型還是2型糖尿病腎病，均存在腎小球足細胞數目減少[ 25-27]。在糖尿病的微量白蛋白尿期，足細胞的密度已經減少，到中大量蛋白尿期足細胞密度下降更加明顯，這與足細胞數目丟失情況的研究相一致。可見，糖尿病腎病患者腎小球足細胞損傷、脫落和數目減少將導致電荷屏障和分子屏障均受損，而產生蛋白尿。

4 肝素治療腎小球疾病的研究

近年來，肝素因其帶有大量負電荷，有利于保護腎小球基膜負電荷屏障，防止白蛋白漏出，在臨床上用于腎臟疾病的治療，已經得到普遍認同。Rops等[28]在狼瘡性腎炎患者及小鼠的研究中發現，腎小球基膜上HS的表達下降，導致固定負電荷丟失，應用肝素治療后，腎小球基膜上HS恢復正常，且有助于阻止免疫球蛋白在腎小球沉積。電荷屏障的改變在腎病綜合征的致病過程中起著非常重要的作用，使用肝素后，能促進蛋白尿轉陰，減低蛋白尿排出，有利于血漿白蛋白恢復，減少長期蛋白尿對腎臟的損害[29]。在糖尿病腎病臨床蛋白尿期，應用肝素后，患者尿白蛋白明顯減少，提示肝素針對糖尿病腎病的濾過膜有類似改善電荷屏障損害的現象[30]。

5 小 結

從實驗動物斑泥螈研究中提出的腎小球流動電位模型，完善了腎臟濾過膜電荷屏障的理論，其產生機制同樣適用于人類，這對于正確理解腎小球濾過膜在生理情況下是如何阻止血漿蛋白進入濾過膜及避免濾過膜堵塞的，以及在病理情況下的蛋白尿的發生、發展方面具有重要作用。腎小球疾病發病率逐年上升，已成為嚴重危害人們健康的世界衛生問題，該病在臨床上涉及多個學科，如腎內科、內分泌科(如糖尿病腎病)、心內科(如高血壓腎病)等。腎臟濾過膜電荷屏障新理論的提出，或能為腎小球疾病的早期診斷、有效治療等提供新的靶點及研究方向。

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