茶多酚對大鼠皮層神經元的保護作用研究

栗建新

茶多酚(tea polyphenols，TP)是從天然植物茶葉中分離提純的30多種酚類化合物的復合體，約占茶葉干物質總量的20%～30%，包括兒茶素、黃烷雙醇、類黃酮和酚酸四類物質。其中兒茶素是茶葉多酚類物質的主要成分，約占多酚類物質的80%，屬黃烷醇類。茶多酚具有抗腫瘤、降血脂、降血壓、降糖、抑菌、抗病毒等多種藥理作用[1-4]。本研究采用體外培養的皮層神經元，酸環境介導損傷模型，觀察茶多酚對體外培養皮層神經元損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1藥品與材料 茶多酚(TP≥98%) (杭州怡倍嘉茶葉科技有限公司)；鹽酸阿糖胞苷(上海華聯制藥有限公司，DMEM/F-12 HYCLONE公司)；胰蛋白酶干粉(美國Gibco公司)；胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)；0.1%多聚左旋賴氨酸(美國sigma公司)；過氧化氫(H2O2)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.2實驗動物 清潔級新生24 h內SD大鼠，河南省實驗動物中心提供。

1.3儀器設備 水套式二氧化碳孵箱(德國GmbH公司);722紫外分光光度(上海第三分析儀器);高速低溫離心機(德國BECMAN產品)。

1.4大鼠皮層神經元的體外培養 取出生后24 h內的SD乳鼠，用無齒鑷取兩側大腦皮層，放入盛有D-Hank’s液的培養皿中，輕輕剔除未去盡的腦膜后，用眼科剪倒碎腦組織1 mm3。然后加入 0.25%胰酶 37℃， 消化15 min，終止消化，離心去上清，加入適當的10%胎牛血清的DMEM/F12，用光滑的細口吸管輕輕吹打數次，用 200目的尼龍網過濾，以 1×106個/ml 的密度將細胞種植在預先放有包被多聚 L賴氨酸培養瓶中，置37℃，5%CO2的培養箱內培養，第2天加入10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h后全部換液，以后每2天換液1次，每次換半量。培養6 d后NSE免疫細胞化學染色確定為神經元。

1.5酸性環境介導皮質神經元損傷模型建立及給藥方式 取培養6 d的大鼠皮層神經元隨機分為以下幾組：①正常組；②酸環境損傷組；③TP高、中、低濃度組(80 mg/L、40 mg/L、20 mg/L)。正常對照組常規換液一次，其余各組細胞除去原培養液，用D-Hank’s液洗滌2遍，酸環境損傷組加入pH 6.0的低糖DMEM液，各給藥組在酸環境損傷處理過程中分別加入含不同濃度TP低糖DMEM液，置細胞培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下培養1 h后，進行指標測定。

1.6生化指標測定 按照試劑盒說明，比色法測定上層培養液中過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA) 和乳酸脫氫酶(LDH)的含量。

2 結果

TP對大鼠皮層神經元經酸環境損傷后細胞培養液中H2O2、LDH和MDA的影響,研究結果顯示，模型組與正常組比較，大鼠皮層神經元在培養液中的 H2O2、LDH和MDA釋放明顯增多(P< 0.01)；TP高、 中、 低各個劑量組對酸環境引起損傷的大鼠皮層神經元在培養液中H2O2、LDH和MDA釋放量具有不同程度的降低作用，與模型組比較差異有統計學意義(P< 0.01)，見表1。

表1 TP對體外培養大鼠皮層神經元損傷時培養基中H2O2、LDH和MDA的影響

注：a，P<0.01 VS 正常組；b，P<0.01 VS 模型組

3 討論

在腦缺血期時，由于氧供不足致使腦組織進行無氧的糖酵解，產物乳酸和ATP水解產物質子的積聚致缺血性組織周圍的pH值顯著下降，導致缺血區組織周圍的pH值明顯地從7.3降到6.0[5]，致使神經元損傷，神經元調往或死亡。H2O2作為體內的一種自由基，它的含量的高低也會直接反映體內過氧化水平的高低；LDH是無氧酵解中的一個關鍵酶，廣泛存在于各種組織細胞中，正常情況下很少從胞漿中釋放，病理情況時細胞膜通透性增高，LDH漏出增加，是細胞受損的一個敏感指標。因此，檢測LDH的漏出量可反映細胞損傷的程度；自由基增加，氧自由基可使細胞膜上多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，引起對細胞的損害，脂質過氧化產物MDA，由于MDA是細胞內脂質過氧化反應的最終產物，化學性質穩定，且其含量能夠體現組織細胞中氧自由基的含量。從本文實驗結果看，酸性環境損傷1 h可使神經元培養液中H2O2、LDH和MDA含量顯著增高，而TP可呈濃度依賴性的減少損傷所引起的H2O2、LDH和MDA含量，提示TP具有較強的抗氧化能力。以上指標從不同的方面證明了TP對皮層神經元的保護作用。

綜上所述，TP對酸介導神經元損傷具有保護作用，其作用機制可能與清除自由基和抗氧化性有關。TP對神經細胞保護作用的其它機制，這尚需進一步研究。

[1] 宿迷菊,王岳飛,駱耀平，等.茶多酚抗炎作用研究進展.茶葉,2006,32(1):10-13.

[2] 林親錄，施兆朋，劉湘新，等.兒茶素和表兒茶素對動物血脂的影響.中國食品學報，2002，2(3):16-20.

[3] 胡秀芳,楊賢強，陳留記.茶多酚對皮膚的保護與治療作用.福建茶葉,2000,12 (2): 44-45.

[4] 胡秀芳,楊賢強.茶兒茶素對癌細胞凋亡作用的研究.茶葉科學,2001,21(1):26-29.

[5] Hoffman WE, Charbel FT, Edelman G,et al. Brain tissue acid-base change during ischemia. Neurosurg Focus,1997,2(5):E2.