老年肺結(jié)核患者外周血NKG2A、NKG2D表達(dá)及相關(guān)分析

魏 蘭,李 輝

結(jié)核病是威脅人類(lèi)健康的重要傳染病之一,其發(fā)病率及死亡高峰逐漸移向老年人[1]。結(jié)核病中以肺結(jié)核最為多見(jiàn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫狀態(tài)相關(guān),主要是細(xì)胞免疫功能。自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的第一道防線,而NK細(xì)胞的有效活化依賴(lài)其活化和抑制信號(hào)之間的動(dòng)態(tài)平衡。NKG2A、NKG2D分別是NK細(xì)胞表面主要的抑制性受體和活化性受體之一,正常情況下,兩種受體表達(dá)趨于平衡。本研究將NKG2A、NKG2D表達(dá)水平的變化作為檢測(cè)指標(biāo),旨在探討NKG2A、NKG2D表達(dá)水平變化對(duì)老年肺結(jié)核患者免疫功能狀態(tài)的影響,并為肺結(jié)核免疫治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 共入選初治肺結(jié)核100例,其中男53例,女47例,年齡60～81歲,平均70.5歲。病例來(lái)源于我院2012年5月～2013年5月的住院患者,未經(jīng)抗癆治療或治療未超過(guò)1月,以防止治療對(duì)結(jié)果的干擾。根據(jù)痰檢結(jié)果分為:(1)初治菌陰肺結(jié)核組:55例,符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷和指南》中“菌陰肺結(jié)核診斷”[2]標(biāo)準(zhǔn)；(2)初治菌陽(yáng)肺結(jié)核組:45例,符合國(guó)家傳染肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)是否合并肺外結(jié)核分為:(1)無(wú)肺外結(jié)核組:48例；(2)合并肺外結(jié)核組:52例(其中淋巴結(jié)核20例,結(jié)核性胸腔積液15例,胸壁結(jié)核10例,結(jié)核性腹腔積液7例)。根據(jù)肺部病灶受累程度分為:1～2個(gè)肺野組46例,3～4個(gè)肺野組40例,5～6個(gè)肺野組14例。根據(jù)有無(wú)空洞分為有空洞組(52例)及無(wú)空洞組(48例)。以同期我院健康體檢者89名為對(duì)照,男49名,女40名；年齡60～85歲,平均72.5歲。

1.2試劑與儀器 NKG2A-PE、NKG2D-PE(R&D公司),CD3- PE-Cy5、CD56-FITC試劑盒(eBioscience公司),PBS稀釋液、牛血清白蛋白、淋巴細(xì)胞分離液(海澳生物工程公司)；FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3方法 抽取所有對(duì)象清晨空腹上肢靜脈血2 ml,EDTA抗凝,6 h內(nèi)處理,并將抗凝血2 ml與等體積的PBS緩沖液混勻,緩慢注入淋巴細(xì)胞分離液液面之上,分離單個(gè)核細(xì)胞,PBS洗滌,將細(xì)胞懸液1200 r/min離心5 min,棄上清,用 PBS 100 μl重懸細(xì)胞。檢測(cè)NKG2A時(shí),管中加入CD56-FITC、NKG2A-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl；檢測(cè)NKG2D時(shí),管中加入CD56-FITC、NKG2D-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl,4 ℃孵育30 min,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。1000 r/min離心10 min,棄上清,PBS沖洗2次,除去未結(jié)合的抗體。轉(zhuǎn)移至流式管,加入適量PBS緩沖液待測(cè)。用流式細(xì)胞儀測(cè)定NK細(xì)胞表面受體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行分析,得到熒光標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

結(jié)核組與體檢組相比,外周血NK細(xì)胞表面受體NKG2D表達(dá)明顯降低,NKG2A的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05,表1)。

表1 結(jié)核組與體檢組NKG2A與NKG2D表達(dá)率的差異(%)

單純肺結(jié)核組與肺結(jié)核合并肺外結(jié)核組相比,肺結(jié)核合并肺外結(jié)核的NKG2A表達(dá)增高(P<0.05)。根據(jù)肺部病灶受累程度分為:1～2個(gè)肺野組、3～4個(gè)肺野組、5～6個(gè)肺野組。結(jié)果顯示,各組間NKG2D表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),NKG2D表達(dá)隨著病灶受累范圍增加而降低。菌陰肺結(jié)核組與菌陽(yáng)肺結(jié)核組、空洞組與無(wú)空洞組相比,NKG2D、 NKG2A表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 老年初治肺結(jié)核患者不同組別NKG2A與NKG2D表達(dá)率的變化(%)

3 討論

NK細(xì)胞既是重要的自然防御細(xì)胞,又是體內(nèi)多種免疫細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)細(xì)胞。肺結(jié)核患者NK細(xì)胞活性降低早有報(bào)道,如Yildiz等[3]、Leung等[4]均報(bào)道肺結(jié)核患者與健康人對(duì)比,NK細(xì)胞顯著下降。翟慧等[5]報(bào)道,肺結(jié)核患者與非肺結(jié)核患者相比,NK細(xì)胞明顯降低。NK細(xì)胞的功能狀態(tài)主要由其表面活化性受體(NKG2D)及抑制性受體(NKG2A)的平衡狀態(tài)決定。二者特異性識(shí)別相應(yīng)配體,分別轉(zhuǎn)導(dǎo)活化或抑制信號(hào),協(xié)同作用調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性。因NK細(xì)胞表達(dá)CD56,不表達(dá)CD3,而NKT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子,本研究為避免NKT細(xì)胞的干擾,將分析區(qū)域設(shè)定為CD56+CD3-的細(xì)胞群設(shè)門(mén)(即對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行分析)。

結(jié)核組與體檢組相比,外周血NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D表達(dá)下降,而抑制性受體NKG2A表達(dá)上調(diào),提示NK細(xì)胞殺傷活性受到抑制。李軍等[6]研究顯示,在結(jié)核桿菌耐熱抗原的刺激下,第12 d出現(xiàn)NK細(xì)胞及T細(xì)胞表面NKG2A表達(dá)量升高,與本研究結(jié)果一致；NKG2D無(wú)顯著變化,與本研究結(jié)果不相符。同時(shí)已有研究表明,在結(jié)核桿菌耐熱抗原刺激初期12 h之后,NK細(xì)胞活化,進(jìn)一步刺激γδT細(xì)胞增殖[7]。而增殖的γδT細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌有很強(qiáng)的殺傷作用,這種作用依賴(lài)于NK細(xì)胞的活化[8]。

結(jié)核菌侵入機(jī)體后,機(jī)體抵抗力較強(qiáng)時(shí),不發(fā)生肺結(jié)核或僅為隱性感染,但結(jié)核菌仍在體內(nèi)存活、繁殖,并播散至其他部位。機(jī)體免疫力降低時(shí),轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性感染,形成相應(yīng)部位的結(jié)核,即肺外結(jié)核。本研究結(jié)果表明,合并肺外結(jié)核組與單純肺結(jié)核組相比,外周血NK細(xì)胞表面抑制性受體(NKG2A)表達(dá)量升高,活化性受體無(wú)明顯變化,提示合并肺外結(jié)核患者NK細(xì)胞殺傷活性明顯降低,機(jī)體免疫功能降低。付笑迎等[9]研究顯示,與健康人外周血NK細(xì)胞相比,結(jié)核性胸腔積液中的NK細(xì)胞降低,NKG2D和NKG2A表達(dá)均明顯增加。提示在結(jié)核局部免疫狀態(tài)中,NK細(xì)胞處于活化狀態(tài),發(fā)揮其殺傷作用。NK細(xì)胞受體表達(dá)在局部免疫狀態(tài)與全身免疫狀態(tài)的不同,有待于進(jìn)一步研究。

本研究根據(jù)肺結(jié)核患者肺部病灶受累程度分為1～2個(gè)肺野組、3～4個(gè)肺野組、5～6個(gè)肺野組。結(jié)果顯示,NKG2D表達(dá)率在3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且隨著病變累及范圍的增加而降低。而NKG2D作為活化性受體,其表達(dá)率降低可減弱NK細(xì)胞對(duì)病原菌的殺傷作用,使結(jié)核桿菌更易發(fā)生免疫逃逸,從而進(jìn)一步加重病情,與翟慧等[5]研究結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn),菌陽(yáng)肺結(jié)核與菌陰肺結(jié)核、肺結(jié)核空洞組與無(wú)空洞組相比,NKG2A、NKG2D表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道,此觀點(diǎn)有待今后研究進(jìn)一步探討。

綜上所述,隨著老年肺結(jié)核患者病情進(jìn)展,機(jī)體免疫功能降低,陷入惡性循環(huán)。檢測(cè)老年肺結(jié)核患者外周血NKG2A、NKG2D的表達(dá)變化,對(duì)了解患者機(jī)體免疫功能的狀態(tài)、病情估計(jì)有一定臨床價(jià)值,可為免疫治療提供重要的理論依據(jù)。

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