煙草側流煙霧對大鼠主動脈炎性微環境和內皮功能的影響

郭 華,趙仙先,張曉娟,張 潔,呂 磊

循證醫學研究已經證實,吸煙獨立于高血壓、糖尿病、年齡等,是一個非常重要的冠心病危險因素,與冠心病患者的預后存在負線性關系[1]。近年研究特別提出,吸煙對血管內皮炎性微環境的影響,同時越來越多的證據顯示,動脈粥樣硬化性疾病是一種以動脈慢性炎癥性改變和內皮功能不全為特點的疾病[2]。而在內皮功能不全的動物模型實驗研究中,較少涉及以血管內皮炎性微環境改變為特點的動物模型。本研究旨在探討煙草側流煙霧對大鼠主動脈炎性微環境和內皮功能的影響,以及是否可通過側流煙霧暴露建立以炎性微環境變化為特點的大鼠內皮功能損傷模型,并用于以后的實驗研究。

1 材料與方法

1.1動物與分組 30只健康SD大鼠,8 w左右大小,體重200～250 g(由南京軍區南京總醫院實驗動物中心提供,SCXK軍2012-0014),隨機分成3組,對照組6只(C組),短期煙霧影響組12只,長期煙霧影響組12只；造模期間,將短期組隨機平均分兩個亞組,即：短期暴露組(S組)和短期暴露并恢復組(S+R組),長期組也分為兩亞組,即：長期暴露組(L組)和長期暴露并恢復組(L+R組)。

1.2方法

1.2.1煙草側流煙霧暴露 按林邦和等[3]的方法自制2個煙草側流煙霧染毒箱(100 cm×60 cm×40 cm)。實驗用煙為常見的商品煙(大豐收牌,焦油含量 13 mg/支,尼古丁含量 1 mg/支,安徽煙草公司)。將短期和長期暴露組各12只同時放入染毒箱內(3 h/次,10根/次,2次/d)。連續4 w后,將短期組處死6只,另外6只放入對照組箱內2 w后處死。而長期組12只大鼠繼續暴露4 w,然后處死其中6只,剩余6只放入對照組箱內2 w后處死。對照組除箱內無點燃的香煙外,其他條件與實驗組相同,10 w后處死。

1.2.2血液動力學指標的測量 在處死大鼠之前,測量各組的尾動脈血壓、心率；在測量的前1 d,通過訓練盡量使大鼠適應儀器及環境,采用無創鼠尾尾套加壓阻斷法對平靜且清醒的大鼠進行測量。每只大鼠測量5次,每次間隔約5 min,取平均值。

1.2.3離體主動脈環內皮依賴的主動脈舒張試驗 在每個實驗的時間點,將需要實驗的大鼠通過腹腔內注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后,快速斷頭處死大鼠,迅速取出約4 cm長的胸主動脈,取2 cm于液氮中凍存用于測量炎性因子、NO及eNOs含量,剩余的主動脈用于內皮依賴性血管舒張功能的測定。將上述大鼠胸主動脈放入4 ℃并持續通以95%O2+5%CO2混合氣體的Krebs緩沖液(NaCl 118 mmol/L,KCl 4.75 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,葡萄糖11 mmol/L,pH=7.4)中,切割成長3 mm左右的血管環,并放入含Krebs緩沖液器官浴槽中。在維持37 ℃的條件下,并持續通以95%O2+5%CO2混合氣體,一端固定,一端通過張力換能器連接PowerLab數據記錄系統。調節血管環的基礎最佳張力至1.8 g,并平衡60 min,期間每15 min換液1次。預先通過去甲腎上腺素(PE 1 μmol/L)收縮主動脈,待其收縮張力達到最大限度后,依次加入不同濃度的乙酰膽堿(ACh,10-8～10-4mol/L)或硝普鈉(10-8～10-4mol/L),記錄每一濃度下主動脈環的舒張程度(以舒張百分比計量),并繪制劑量反應曲線[4-5]。

1.2.4主動脈NO含量測定 組織中的NO化學性質活潑,易于分解代謝,單純測量NO結果差異較大。因此,以測量NO的最終代謝產物NOx(亞硝酸鹽NO2-與硝酸鹽NO3之和)來反映體內NO水平。將部分大鼠主動脈放入含有蛋白抑制劑的無菌磷酸鹽中,在4 ℃的條件下以12 000g離心10 min。取上清液,嚴格遵循說明書操作步驟,利用NO試劑盒(南京碧云天生物公司),用分光光度儀在540 nm處測定,根據公式計算NOx含量。

1.2.5eNOs含量測定 采用Western blot法測定iNOS和eNOS表達水平。取胸主動脈組織用冷TBS洗滌2～3次,置于勻漿器中,加RIPA裂解液提取蛋白,用BCA法進行蛋白定量。在蛋白樣品中其體積5倍的蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min、冷卻,離心后取上清,進行SDS-PAGE電泳、轉膜。室溫下將轉好的膜置于脫色搖床上,用5%的脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗eNOS(稀釋度1∶2000,美國Anbo Bio公司),4 ℃過夜；TBST漂洗3次,5 min/次；加二抗(稀釋度1∶3000,美國Anbo Bio公司),室溫30 min后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,5 min/次。將A和B 兩種試劑在離心管中等體積混合,將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸1～2 min后,去盡殘液,包好,放入X光片夾中曝光。將膠片進行掃描存檔,Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.2.6主動脈炎性因子的mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法測定主動脈中炎性因子(ICAM-1、TNFα、IL-1β)的mRNA。用標準Trizol(美國Sigma-Aldrich)法提取目標因子的總RNA。隨后用反轉錄方法(FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒,上海天根)反轉4 μg的總RNA到40 μl cDNA體系中,再用β-actin作為內參進行調節,使cDNA的起始量達到一致。依據上海捷瑞生物工程有限公司提供的方法進行引物設計(表1),實時定量PCR(RT-PCR)根據THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix(TOYOBO日本)和Applied Biosystems Step OneTM(ABI 美國)實驗手冊,基于SYBR green擴增方法進行試驗。

表1 引物設計

表2 煙草側流煙霧對大鼠血壓、心率的影響(n=6)

表3 各組主動脈中NOx、炎性因子mRNA和eNOs蛋白的比較(n=6)

2 結果

2.1血液動力學變化 吸入側流煙霧組大鼠尾動脈血壓較對照組有明顯升高(P<0.05)。短期組在停止吸入煙霧2 w后,升高的血壓明顯下降,與對照組無明顯差異(P>0.05)；而長期吸煙組即使停止煙霧干預2 w,血壓仍較高。見表2。

2.2各組(ACh)誘導的內皮依賴性血管舒張功能的變化 除了S+R組外,其他吸入煙霧組的胸主動脈環對ACh誘導的內皮依賴性舒張反應受損明顯,ACh所致的最大舒張比正常對照組下降了28.74%(P<0.01)；短期吸入煙霧組戒煙2 w,可明顯改善胸主動脈的內皮依賴性舒張,且與對照組無明顯差異(P>0.05)。但長期吸入煙霧后戒煙不能改善其舒張功能。L組與S組比較,L組舒張百分比下降幅度較S組高(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度ACh對各組主動脈內皮依賴的血管舒張反應的影響

2.3各組NO含量比較 吸入煙霧組主動脈NOx的含量低于對照組,其中以L和L+R組降低最為明顯,S組次之,提示這3組NO含量較對照組顯著降低(P<0.05)；雖然S+R組主動脈中NO含量也偏低,但與對照組無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.4各組主動脈中eNOs蛋白表達的變化 吸入煙霧組主動脈eNOs蛋白表達最高,順序依次為S+R、S、L+R、L,其中以L、L+R、S組與對照組比較有統計學差異(P<0.05),而S+R組與對照組無明顯差異(P>0.05)。見表3、圖2。

2.5各組中主動脈炎性因子mRNA的變化 L、L+R、S組其ICAM-1、TNFα、IL-1β的mRNA水平較C和C+R組明顯升高(P<0.05)；隨著暴露時間的延長,其炎性因子逐漸升高(P<0.05)。L組和L+R組之間炎性因子水平無統計學差異；而S+R組與C組相比,TNFα和IL-1β無統計學差異。見表3。

圖2 各組Western blot eNOs蛋白表達

3 討論

動脈粥樣硬化性疾病的病理生理變化初始于血管內皮功能不全。煙草煙霧中含有大約4300種化學成分。其中大部分如可誘發血管的炎癥環境、提升氧化應激、促進血小板聚集、抑制纖維蛋白原溶解、擾亂脂質代謝、激活RAS系統等,這些作用相互影響,并產生級聯放大效應,引起血管內皮功能不全,最終導致血管粥樣硬化性疾病[6]。近年研究特別提出,吸煙對血管內皮炎性環境有影響,而且認為動脈粥樣硬化本質上是一種以慢性炎癥性改變和內皮功能不全為特點的疾病[7-8]。煙草的復雜而綜合的多因子作用機制,以及可誘發炎性微環境改變的特點很難被其他動物模型所模擬。因此,本研究的另一個目的就是將暴露于煙草側流煙霧中作為干預因素,制造以炎性微環境改變為特點的內皮功能不全動物模型,用于以后的研究工作。

血管活化的炎性環境主要表現在炎性標志物的升高[9]。ICAM-1、TNFα、IL-1β是近年研究中已證實的炎性標志物[10]。在炎性環境的刺激下,這些因子明顯升高,它們可增加循環血液中白細胞和血管內皮細胞的黏附力,促使白細胞從血管中向內皮組織中趨化聚集；吸引單核細胞滲透入動脈內膜,造成局部的微炎性改變[11]；增加炎性細胞與平滑肌細胞之間的黏附力；影響急性蛋白的合成,同時可以促進放大炎性級聯反應,從而損傷內皮細胞,破壞內皮的完整性,影響內皮功能[12]。在本研究中,隨著煙草煙霧暴露的時間延長,其ICAM-1、TNFα、IL-1β的mRNA明顯升高,而短期組經戒煙恢復后,其炎性因子有明顯下降,TNFα甚至可基本恢復至正常對照組水平。但是長期暴露組停止煙草煙霧暴露后,其炎性因子無明顯改變。提示煙草煙霧確實可引起血管的炎性微環境改變,誘發炎性因子表達增加,且具有時間依賴性的損害特點。且在一定的時間范圍內,煙草造成的損害可經戒煙而改善。

內皮功能主要由NO的產量和生物活性,以及血管內皮的完整性來體現[13]。NO由血管內皮經eNOs酶催化L-精氨酸而產生,越來越多的數據證實,eNOs/NO通路異常是導致NO生物活性減少最主要的原因。而在動物實驗中,以內皮依賴的血管舒張功能來反映血管的內皮功能已被廣泛接受[14]。在本研究中,無論短期還是長期暴露于煙草側流煙霧中的大鼠,其主動脈的NO產量、eNOs表達均較正常對照組明顯降低。相對于對照組,煙霧暴露組其內皮依賴的血管舒張功能明顯受損,同時血壓也明顯升高。這些結果提示,暴露于煙草側流煙霧中,無論是在微觀水平還是宏觀水平,都有大鼠主動脈內皮功能異常的表現。而且隨著暴露時間的延長,長期吸煙比短期吸煙對內皮功能損害進一步加重,似乎表現出一種時間依賴性的特點。但是在短期吸煙組中,經過停止吸煙一段時間后,其主動脈內皮功能受損的指標基本可恢復至未吸煙的狀態下,而長期吸煙組無論是否停止吸煙,其主動脈內皮功能的損害很難恢復。提示在一定的時間范圍內,煙草煙霧造成的血管損害,可通過停止接觸煙霧而逆轉。同時也提示,在以后的研究中,如果吸入煙草側流煙霧引起內皮功能不全的模型制造成功后,若要觀察某些干預因素對其的作用,最好使用暴露8 w以上的模型,避免出現假陰性結果的可能。

綜上所述,將大鼠暴露于煙草側流煙霧中,無論短期還是長期,都可誘發大鼠主動脈炎性微環境改變和內皮功能不全,導致其血管動力學的改變；如果要將此類動物模型用于以后的實驗研究,應盡量采用長期(8 w以上)暴露的大鼠模型,避免由于大鼠機體自身調節恢復而影響實驗結果的真實有效性。

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