束縛應(yīng)激后大鼠肝臟PPARβ/δ mRNA和蛋白表達(dá)的變化

任冰穩(wěn)，葉 平，田海濤

現(xiàn)代社會(huì)人們受到的應(yīng)激因素增加，糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂紊亂等代謝疾病發(fā)生率明顯升高。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激與代謝疾病的發(fā)生關(guān)系密切[1-2]，但分子機(jī)制并不清楚。過(guò)氧化物酶體增殖物激活因子(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)屬于細(xì)胞核甾體類(lèi)受體超家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三種亞型。近年的研究發(fā)現(xiàn)，PPARβ/δ在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善胰島素敏感性中發(fā)揮重要作用，有望成為高脂血癥、2型糖尿病治療新靶點(diǎn)[3]。

肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的重要器官，三種PPARs在肝臟均有不同程度的表達(dá)，其中PPARβ/δ含量豐富，許多葡萄糖和脂肪酸代謝基因受PPARβ/δ影響明顯。本研究以束縛應(yīng)激大鼠為模型，觀察束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血TG、血糖及肝臟中PPARβ/δ表達(dá)的影響，初步探討應(yīng)激時(shí)代謝異常發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 引物由北京賽百盛生物公司合成，DNA marker購(gòu)自北京天根生化科技公司，RNA-Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連Takara公司，羊抗鼠PPARβ/δ一抗、羊抗鼠GAPDH一抗、HRP兔抗羊二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 健康雄性Wistar大鼠32只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)為SCXK-軍2007-004)，適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后，參考文獻(xiàn)[4-5]方法，按體重隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(C)、束縛1 w組(R1)、束縛2 w組(R2)和束縛4 w組(R4)。實(shí)驗(yàn)周期為4 w。對(duì)照組大鼠行抓取動(dòng)作后放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，R4組大鼠進(jìn)行束縛應(yīng)激4 w；R2組大鼠前2 w處理同對(duì)照組，第3 w開(kāi)始接受束縛應(yīng)激2 w；R1組前3 w處理同對(duì)照組，第4 w時(shí)進(jìn)行應(yīng)激1 w。應(yīng)激在9：00～12：00和14：00～17：00進(jìn)行，期間所有大鼠均禁食、水。試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉后下腔靜脈取血，靜置離心取上清。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血TG、血糖水平；血清皮質(zhì)酮濃度采用放免法測(cè)定，血清去甲腎上腺素濃度采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，血清胰島素采用放免法測(cè)定，均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。胰島素敏感指數(shù)(ISI)=In1/(空腹血糖×空腹胰島素)。迅速取出肝臟，置液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PPARβ/δ mRNA表達(dá)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[5]方法，迅速取出保存在液氮中的各組肝組織樣本，采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA。嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)中的程序操作，先將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再配PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增PPARβ/δ(上游引物為5'-ATCGGCCTGGCCTTCTAAAC-3'，下游引物為5'-GTCTCTGTAGATCTCTTGC-3'，擴(kuò)增片段為239 bp)、內(nèi)參照物GAPDH(上游引物為5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'，下游引物為5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'，擴(kuò)增片段為196 bp)，按照擴(kuò)增條件擴(kuò)增cDNA。將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 mg/L)電泳后，用GelDoc2000凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算PPARβ/δ與GAPDH的光密度值，各組肝組織PPARβ/δ mRNA的相對(duì)表達(dá)量以?xún)烧叩谋戎?OD值)表示。

1.2.3PPARβ/δ蛋白表達(dá)測(cè)定(Western blot) (1)提取肝臟組織總蛋白：按照100 mg肝組織加入500 μl的比例加入蛋白提取液，冰上充分研磨并靜置30 min后，12 000 r/min離心15 min。取上清液，按1∶4的比例加入上樣緩沖液后煮5 min，于-20 ℃冰箱備用。(2)電泳及轉(zhuǎn)移蛋白：測(cè)定樣品蛋白含量后，各組樣品按照20 μg的上樣量，先進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，繼之轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上。(3)免疫反應(yīng)：轉(zhuǎn)移完成后，5%的脫脂奶粉封閉1 h，一抗中4 ℃過(guò)夜。用TBST洗膜后入二抗室溫下孵育2 h，洗膜后暗室中超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，X線片壓片曝光，用Image J圖像分析軟件分析結(jié)果，各樣品的蛋白表達(dá)量以各目的條帶與內(nèi)參照的灰度值和面積的乘積之比表示。

2 結(jié)果

2.1束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血清皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素、胰島素水平的影響 由表1可見(jiàn)，與C組大鼠相比，R1、R2、R4組大鼠血清皮質(zhì)酮、去甲腎上腺素、胰島素水平均升高(P<0.05或P<0.01)；但R1、R2、R4組間血清皮質(zhì)酮、去甲腎上腺素、胰島素?zé)o明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素、胰島素濃度的比較(n=8)

2.2束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血TG、血糖和ISI的影響 由表2可見(jiàn)，與C組大鼠相比，R1、R2、R4組大鼠血清TG和血糖水平升高(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01)；但R1、R2、R4組間血清TG、血糖和ISI無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠血TG、血糖濃度和ISI的比較(n=8)

2.3束縛應(yīng)激對(duì)大鼠肝臟PPARβ/δ mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1。由表3可見(jiàn)，與C組大鼠相比， R1、R2、R4組大鼠肝臟中PPARβ/δ mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，但R1、R2、R4組間肝臟中PPARβ/δ mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠肝臟PPARβ/δ mRNA表達(dá)水平的比較(n=8)

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠肝臟PPARβ/δ mRNA表達(dá)水平

2.4束縛應(yīng)激對(duì)大鼠肝臟PPARβ/δ蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。由表4可見(jiàn)，與C組大鼠相比，R1、R2、R4組大鼠肝臟中PPARβ/δ蛋白表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)，但R1、R2、R4組間肝臟中PPARβ/δ蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表4 肝臟PPARβ/δ蛋白表達(dá)水平(灰度值，±s，n=8)

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠肝臟PPARβ/δ蛋白表達(dá)水平

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激大鼠皮質(zhì)酮和去甲腎上腺素分泌增加，應(yīng)激后神經(jīng)內(nèi)分泌的改變以交感神經(jīng)興奮和下丘腦-垂體-腎上腺激活為特征，這是應(yīng)激后的非特異性反應(yīng)，提示應(yīng)激模型制作成功。

應(yīng)激后機(jī)體處于高代謝狀態(tài)，大腦中樞興奮、血液循環(huán)加快、心臟負(fù)荷加重。本研究發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激大鼠血甘油三酯、血糖升高，ISI降低。血糖、甘油三酯均是機(jī)體重要的能源物質(zhì)，胰島素敏感性下降有利于節(jié)省能源物質(zhì)，為大腦中樞、紅細(xì)胞等只能利用葡萄糖的器官和主要應(yīng)激組織提供充足的能量供應(yīng)。但是，長(zhǎng)期循環(huán)中血糖和甘油三酯升高會(huì)對(duì)血管和組織器官造成損害，導(dǎo)致多種代謝性疾病的發(fā)生。

肝臟中PPARβ/δ含量豐富，包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸和葡萄糖氧化利用、戊糖磷酸途徑的多種基因受PPARβ/δ調(diào)控[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激導(dǎo)致肝臟中PPARβ/δ mRNA和蛋白表達(dá)下降。肝臟中PPARβ/δ mRNA和蛋白表達(dá)下降可能導(dǎo)致肝臟葡萄糖和脂肪酸利用減少，促進(jìn)肝糖輸出和TG、血糖升高。

束縛應(yīng)激各組大鼠之間血TG、血糖、ISI水平無(wú)明顯差異，肝臟PPARβ/δ mRNA和蛋白表達(dá)也無(wú)明顯差異，提示束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血TG、血糖和肝臟PPARβ/δ表達(dá)的影響主要與束縛應(yīng)激本身有關(guān)。

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