檢測BALF中CRP 和T細(xì)胞亞群對肺結(jié)核與肺癌鑒別診斷的意義

周 菁，肖貞良，田 坤，吳 奎，陳 章

在病理學(xué)及細(xì)菌學(xué)檢查陽性結(jié)果缺乏時，肺癌與肺結(jié)核的鑒別診斷是臨床工作中的難點(diǎn)之一，特別是結(jié)核球與周圍型肺癌，粟粒樣肺結(jié)核與肺泡癌，肺門淋巴結(jié)結(jié)核與中央型肺癌的鑒別。支氣管肺泡灌洗液(BALF)是通過對支氣管以下肺段或亞段反復(fù)灌洗、回收而得到的，通過對其進(jìn)行一系列檢測和分析，可以早于疾病全身變化前了解局部病變的性質(zhì)特點(diǎn)和活動程度，有助于確立診斷。本研究采用聯(lián)合檢測43例肺癌和37例肺結(jié)核患者的BALF的C反應(yīng)蛋白(CRP)和T淋巴細(xì)胞亞群的方法，探討其在肺結(jié)核與肺癌鑒別診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1病例資料 20份來自健康體檢中心的健康體檢者為健康對照組，80份BALF標(biāo)本來自我院呼吸內(nèi)科2012年6月～2013年2月收治的患者。其中肺癌組43例(男31例，女12例)，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，并通過胸部CT、實(shí)驗(yàn)室檢查等排除感染因素；患者年齡41～77(50.0±4.0)歲，其中鱗癌21例，腺癌15例，小細(xì)胞肺癌7例。肺結(jié)核組37例，經(jīng)臨床確診，其中痰涂陽性13例，CT表現(xiàn)為結(jié)核球12例；粟粒樣肺結(jié)核8例，空洞5例，滲出性病灶12例；患者年齡18～66(32.0±5.0)歲。

1.2BALF采集 采用Olympus CV-150型電子纖支鏡，由同一檢查醫(yī)師操作，先行常規(guī)氣道檢查后，根據(jù)胸部CT提示，健康體檢者取右肺上葉開口，在刷檢或活檢前行病變相應(yīng)肺段支氣管肺泡灌洗：纖支鏡前端嵌入病變所在段或亞段支氣管開口處，每次注入生理鹽水30 ml，收集灌洗液15 ml以上，30 min內(nèi)送檢。

1.3CRP檢測方法 CRP采用免疫比濁法，試劑由上海藍(lán)怡科技有限公司提供，采用西門子 Bayer ADVIA 2400 全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.4T淋巴細(xì)胞亞群檢測 所用試劑包括溶血素及抗體均購自法國Immunotech公司，采用美國Guave公司6HT流式細(xì)胞儀進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測。

樣品制備：取新鮮獲得的BALF 15 ml，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾掉雜質(zhì)和痰液，400×g離心10 min去上清，PBS洗滌2次，混勻；每管以2×106/ml細(xì)胞數(shù)，于流式上樣管加入CD4 FITC/CD8 PE/CD3 Per-CP熒光抗體20 μl，室溫避光孵育20 min，加1∶9配制的溶血素2 ml，避光8 min，200×g離心5 min，倒掉上清液，加入PBS緩沖液2 ml，200×g離心5 min，去上清，加0.5 ml PBS緩沖液重懸細(xì)胞,同時設(shè)相對應(yīng)同型對照。

以熒光微球校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀光路，采用cellquest pro軟件獲取與分析數(shù)據(jù)。建立FSC/SSC、SSC/CD3、CD4/CD3、CD8/CD3熒光點(diǎn)圖，以CD3細(xì)胞群圈門(R1)，每管獲取1萬個細(xì)胞，根據(jù)同型對照設(shè)十字門，分析T淋巴細(xì)胞表面CD3+、CD4+和CD8+抗原的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1肺結(jié)核、肺癌和健康志愿者BALF中CRP濃度及T細(xì)胞亞群比較 在BALF中，肺結(jié)核組的CRP濃度為(32.50±6.89)mg/L，明顯高于肺癌組的(5.32±1.27)mg/L和健康對照組的(4.64±1.01)mg/L(P<0.05)，肺癌組與健康對照組相比無明顯差異(P>0.05)。與肺結(jié)核組和健康對照組相比，肺癌組BALF中的T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著下降(P<0.05)，而CD8+比例無明顯差異(P>0.05)。各種肺癌類型之間CD4+、CD8+細(xì)胞比較無明顯差異(P>0.05)，肺結(jié)核組和健康對照組相比，沒有顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2BALF中CRP及CD4+細(xì)胞比例診斷肺結(jié)核及肺癌的敏感度和特異度 從表2可見，當(dāng)BALF中CRP濃度為20.1 mg/L時，診斷肺結(jié)核的敏感度最高，為84.3%，特異度54.2%；而當(dāng)CRP濃度為29.2 mg/L時，敏感度55.0%，特異度達(dá)91.4%。BALF中T細(xì)胞分類CD4+細(xì)胞比例為38.7%時，診斷肺癌的敏感度為79.0%，特異度45.1%；當(dāng)CD4+細(xì)胞比例為34.2%時，診斷肺癌的敏感度和特異度分別為51.0%和87.9%。由ROC分析得出，鑒別診斷肺結(jié)核的CRP濃度最佳臨界值為20.1 mg/L，鑒別診斷肺癌的CD4+臨界值為38.7%。

表1 兩組BALF中T細(xì)胞亞群分布比較(%)

表2 BALF中CRP和CD4+診斷肺結(jié)核及肺癌的敏感度和特異度

3 討論

肺癌與肺結(jié)核同屬呼吸道常見疾病，對具有典型臨床及影像學(xué)表現(xiàn)的病例兩者鑒別并不困難，但對于部分表現(xiàn)不典型病例，特別是結(jié)核球與周圍型肺癌，粟粒樣肺結(jié)核與肺泡癌，肺門淋巴結(jié)結(jié)核與中央型肺癌的鑒別則較為困難。因此，從氣道分泌物特別是肺泡灌洗液中尋找某些具有鑒別診斷的標(biāo)志物是研究的熱點(diǎn)之一。目前，主要的標(biāo)志物研究多集中在部分腫瘤標(biāo)志物、免疫細(xì)胞、炎性因子上，但多為單個標(biāo)志物研究，特異性較低[1]。BALF可以直接獲得下呼吸道及肺泡上皮表面襯液，對其CRP含量及淋巴細(xì)胞亞群測定，可以更準(zhǔn)確了解肺病變局部變化。因此，本研究通過對不同類型的肺癌及肺結(jié)核肺BALF中C反應(yīng)蛋白和T細(xì)胞亞群進(jìn)行聯(lián)合檢測，探討在肺癌及肺結(jié)核鑒別診斷中的意義，提高輔助診斷的特異性。

CRP是肝臟在細(xì)胞因子IL-6作用下合成的非特異性急性時相蛋白，在機(jī)體的天然免疫過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。健康人血清中僅含微量CRP，當(dāng)機(jī)體感染后2 h左右即可升高，感染一旦控制，CRP 水平則迅速下降。因此，CRP 的變化是反映炎癥、組織損傷程度的敏感指標(biāo)之一[2]。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展是炎性反應(yīng)的過程，其變質(zhì)、滲出、增生貫穿于疾病的整個過程。CRP的表達(dá)程度對肺結(jié)核的診斷、轉(zhuǎn)歸判斷有一定的價(jià)值。有報(bào)道肺結(jié)核患者血清CRP檢測的靈敏度在86.7%，但特異度在20%以下[3-5]。

肺癌的發(fā)生與全身和局部免疫監(jiān)視功能降低有關(guān)，腫瘤免疫的主要方式之一是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。在腫瘤發(fā)生的局部，CD4+T細(xì)胞在抗原刺激下可分泌細(xì)胞因子而作用于腫瘤細(xì)胞，在早期殺傷甚至消滅腫瘤細(xì)胞。如果局部CD4+T細(xì)胞數(shù)減少造成T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力下降，則對腫瘤殺傷無力，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，腫瘤增殖。而CD8+T細(xì)胞除分泌免疫抑制因子產(chǎn)生免疫抑制作用外，還可以通過與CD4+T細(xì)胞爭奪部分細(xì)胞因子來維持自身生長，造成腫瘤局部微環(huán)境內(nèi)部分細(xì)胞因子耗盡，免疫功能紊亂[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組的BALF中CRP濃度明顯高于肺癌組(P<0.05)；肺癌組BALF中的T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值顯著下降(P<0.05)，而CD8+比例無明顯差異(P>0.05)，各種肺癌類型之間CD4+、CD8+細(xì)胞比較無明顯差異(P>0.05)。診斷肺結(jié)核時，BALF中CRP濃度為29.2 mg/L時特異性最高，為91.4%；診斷肺癌時，BALF中T細(xì)胞分類CD4+細(xì)胞比例為34.2%時特異性最高，為87.9%。

這說明，當(dāng)機(jī)體受到微生物感染時，CRP作為一種感染急性時相反應(yīng)蛋白，在局部病灶濃度升高，激活補(bǔ)體和加強(qiáng)吞噬作用，從而清除入侵機(jī)體的病原微生物和損傷、壞死、凋亡的組織細(xì)胞，因此，對肺部感染性疾病如肺結(jié)核的診斷敏感性較高；而肺癌患者局部BALF中卻少有CRP的升高。同時，肺癌患者在早期全身免疫功能下降不明顯時，局部免疫功能的下降可能造成腫瘤增殖，通過BALF中T細(xì)胞亞群分析，可以早于全身免疫功能紊亂之前發(fā)現(xiàn)局部免疫功能的變化，便于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。測定BALF中T細(xì)胞亞群的變化，也可為腫瘤的診斷提供線索。

本研究說明，聯(lián)合檢測分析BALF中CRP濃度和T細(xì)胞亞群，可作為診斷困難的肺結(jié)核與肺癌鑒別診斷的輔助手段之一。

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