自由探索實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物特質(zhì)焦慮情緒中的應(yīng)用

肖新洋,魏 盛(綜述),張惠云(審校)

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250355)

焦慮是應(yīng)激過程中常見的情緒反應(yīng),過度的焦慮會(huì)干擾認(rèn)知功能活動(dòng)[1-5],妨害個(gè)體做出適宜的判斷，極大地削弱其應(yīng)對(duì)能力。20世紀(jì)70年代初,Cattle等提出特質(zhì)焦慮和狀態(tài)焦慮的概念，隨后Spielberg提出了完整的特質(zhì)-狀態(tài)焦慮理論，將狀態(tài)焦慮描述為人們于特定情景中所產(chǎn)生的特定反應(yīng)狀態(tài)，如緊張、憂慮、恐懼等，一般持續(xù)時(shí)間較短且容易受外部刺激影響，是一種狀態(tài)[6]。狀態(tài)焦慮是個(gè)體在特定的情境中所產(chǎn)生的暫時(shí)的情緒波動(dòng)狀態(tài)，其特點(diǎn)是由緊張和憂慮所造成的一些可意識(shí)到的主觀感覺，是自主神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。它是一種復(fù)雜的、廣泛性的情緒狀態(tài)或反應(yīng)，并且隨時(shí)間的不同其強(qiáng)度處于不斷波動(dòng)變化中[7]。特質(zhì)焦慮則是隨時(shí)間變化相對(duì)穩(wěn)定且具有個(gè)體差異的焦慮，是一種人格特質(zhì)[8]。狀態(tài)焦慮是特定情境引起的暫時(shí)不安狀態(tài)，短暫且容易受外部刺激影響，而特質(zhì)焦慮則被認(rèn)為是個(gè)體持續(xù)性特征且隨時(shí)間變化相對(duì)穩(wěn)定[9]。

Spielberg提出的特質(zhì)-狀態(tài)焦慮理論對(duì)于動(dòng)物也是適用的，從進(jìn)化角度講，動(dòng)物所表現(xiàn)的防御反應(yīng)是人類恐懼和焦慮反應(yīng)的原始成分，動(dòng)物所表現(xiàn)的恐懼樣反應(yīng)與人類的焦慮反應(yīng)是相似的[10]。人類的焦慮反應(yīng)主要表現(xiàn)為逃避現(xiàn)實(shí)、逃跑行為、警覺性提升，同樣的行為反應(yīng)也可于動(dòng)物身上觀察到。目前評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物狀態(tài)焦慮的方法有很多，如高架十字迷宮[11-15]、曠場試驗(yàn)[6,16-18]和明暗箱[19-21]等，而用來評(píng)價(jià)特質(zhì)焦慮的方法目前只有自由探索實(shí)驗(yàn)一種[22]。自由探索實(shí)驗(yàn)是一種非條件反射模型，以動(dòng)物自發(fā)的恐懼樣反應(yīng)[23]為行為學(xué)原理，由Griebel等[22]發(fā)展而來，已被廣泛應(yīng)用于大鼠和小鼠等嚙齒類動(dòng)物焦慮行為學(xué)探索。

1 自由探索實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理與歷史沿革

自由探索實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物被放到一個(gè)包括熟悉和陌生部分的環(huán)境中自由走動(dòng)(圖1)，由于動(dòng)物對(duì)熟悉和陌生之間有選擇性，預(yù)測特質(zhì)焦慮水平不同動(dòng)物會(huì)偏好不同環(huán)境[22]。自由探索實(shí)驗(yàn)最初由Hughes[24-25]描述，觀察到Wistar大鼠通常偏好陌生環(huán)境。隨后Griebel等[22]對(duì)比了兩種不同品系的小鼠BALB/cA和C57BL/6，觀察到BALB/cA小鼠對(duì)熟悉環(huán)境顯示出顯著的偏好，然而C57BL/6小鼠則對(duì)陌生環(huán)境顯示出顯著的偏好，揭示了自由探索實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分特質(zhì)焦慮，同時(shí)還有一些證據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)期間焦慮狀態(tài)并沒有改變。Misslin等[26-27]觀察到Swiss大鼠除非被強(qiáng)制進(jìn)入陌生環(huán)境否則并不會(huì)顯示出恐懼的生理學(xué)跡象,即大鼠對(duì)于新環(huán)境具有恐懼樣行為。Belzung等[28]于1994年分析證明自由探索實(shí)驗(yàn)中的測量變量和狀態(tài)焦慮模型中的變量因子不同，說明自由探索實(shí)驗(yàn)所評(píng)價(jià)的焦慮是特質(zhì)焦慮，而且自由探索實(shí)驗(yàn)被證明隨時(shí)間變化是穩(wěn)定的。

2 自由探索實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

2.1器材 模型裝置是根據(jù)Griebel等[22]的描述建立的，裝置的尺寸是基于Hughes[24-25]的工作設(shè)計(jì)(圖1)。該裝置由一個(gè)木質(zhì)主體箱構(gòu)成，分為兩個(gè)隔間，每個(gè)隔間細(xì)分為三個(gè)探索單元(30 cm ×20 cm×20 cm)，每個(gè)單元之間通過小的開口互聯(lián)，兩個(gè)隔間通過一個(gè)可抽拉的隔板來分離。

圖1 自由探索箱構(gòu)造圖

2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了考察同一品系大鼠自由探索實(shí)驗(yàn)測得焦慮樣行為是否隨時(shí)間變化而波動(dòng)，以此證明該焦慮樣行為屬特質(zhì)焦慮，分別進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)[29]。

2.2.1實(shí)驗(yàn)1 用30只Wistar大鼠間隔1周進(jìn)行兩次自由探索實(shí)驗(yàn)。為使動(dòng)物熟悉隔間，測試前大約24 h，裝入隔板，將動(dòng)物放入裝置內(nèi)的一個(gè)隔間，預(yù)留另一個(gè)隔間做正式測試。熟悉區(qū)用墊料覆蓋底部并可以自由進(jìn)食進(jìn)水。測試當(dāng)日，將熟悉區(qū)與陌生區(qū)間隔板抽去，暗淡紅光下觀察動(dòng)物10 min，測定陌生區(qū)停留時(shí)間等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠中。每次實(shí)驗(yàn)后，用10%乙醇溶液清潔自由探索箱。

2.2.2實(shí)驗(yàn)2 該實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)1大部分相同，不同之處是兩次實(shí)驗(yàn)間隔周期改為4周，同時(shí)觀察時(shí)間由10 min增加到15 min。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3.1數(shù)據(jù)分析的實(shí)驗(yàn)參數(shù) 陌生區(qū)停留時(shí)間百分比(陌生區(qū)停留時(shí)間/總時(shí)間×100%)，評(píng)估對(duì)區(qū)域的偏好，初測和復(fù)測采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來比較，然后分別和50%進(jìn)行對(duì)比。

2.3.2復(fù)測信度分析 陌生區(qū)停留時(shí)間百分?jǐn)?shù)用ICC[35](組內(nèi)相關(guān)系數(shù))和Kappa[31]兩種數(shù)據(jù)檢驗(yàn)。一般認(rèn)為ICC或Kappa>0.75，則認(rèn)為可信度很好；處于0.5～0.75之間，則認(rèn)為可信度良好，尚可接受；而<0.5，則認(rèn)為可信度很差，測量方法或工具所得結(jié)果不可靠[32]。

2.4結(jié)果分析

2.4.1實(shí)驗(yàn)1 整個(gè)10 min的觀察期間初測過程中動(dòng)物并沒有對(duì)陌生區(qū)表現(xiàn)出明顯的偏好，但這種偏好在復(fù)測過程中表現(xiàn)得非常明顯(圖2)。陌生區(qū)停留時(shí)間百分?jǐn)?shù)的結(jié)果顯示初測和復(fù)測具有很好的一致性和較好的可信度(ICC>0.5,Kappa>0.75)。

#表示測試中在陌生區(qū)的時(shí)間百分?jǐn)?shù)和50%比較，P<0.05

圖2對(duì)于陌生區(qū)的偏好(實(shí)驗(yàn)1)

2.4.1實(shí)驗(yàn)2 整個(gè)15 min的觀察期間初測與復(fù)測過程中，動(dòng)物對(duì)于陌生區(qū)均有明顯的偏好(圖3)。陌生區(qū)停留時(shí)間百分?jǐn)?shù)的結(jié)果顯示初測和復(fù)測具有很好的一致性和較好的可信度(ICC>0.5,Kappa>0.75)。

****表示測試中在陌生區(qū)的時(shí)間百分?jǐn)?shù)和50%比較，P<0.05

圖3對(duì)于陌生區(qū)的偏好(實(shí)驗(yàn)2)

陌生區(qū)停留時(shí)間百分比反映了動(dòng)物的焦慮狀態(tài)，探究陌生區(qū)和熟悉區(qū)單元格總數(shù)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力，陌生區(qū)探究單元格數(shù)反映了動(dòng)物陌生環(huán)境內(nèi)的探索行為，與焦慮程度有一定相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2結(jié)果表明，自由探索箱陌生區(qū)停留時(shí)間百分比復(fù)測信度好，即評(píng)價(jià)焦慮狀態(tài)的穩(wěn)定性和可靠性較好，且沒有因?qū)嶒?yàn)時(shí)間變化而波動(dòng)，這與大鼠對(duì)陌生區(qū)的偏好相吻合，提示該指標(biāo)可能作為評(píng)價(jià)大鼠特質(zhì)焦慮的參數(shù)。

3 問題與展望

自由探索實(shí)驗(yàn)雖然作為評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物特質(zhì)焦慮情緒的可靠方法已經(jīng)建立并應(yīng)用，但其中也面臨許多問題。

3.1自由探索實(shí)驗(yàn)裝置自動(dòng)化問題 自由探索實(shí)驗(yàn)主要依靠人來評(píng)分，會(huì)因?yàn)闇y試者之間的主觀性而產(chǎn)生結(jié)果偏倚[33]，一個(gè)自動(dòng)控制系統(tǒng)可以避免這些問題，電腦算法一直按照同樣的方式運(yùn)行，可以同時(shí)對(duì)許多器械進(jìn)行評(píng)分[34]，自動(dòng)化通過對(duì)空間參數(shù)的表達(dá)(如距離、速度)可以提升對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的評(píng)價(jià)，但目前自由探索實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化仍不成熟，亟待完善。

3.2自由探索實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及理論驗(yàn)證方面的問題 不同品系大鼠自由探索實(shí)驗(yàn)并未進(jìn)行，因此對(duì)其用于大鼠特質(zhì)焦慮評(píng)價(jià)證據(jù)不足。盡管已有學(xué)者報(bào)道不同品系小鼠[23]對(duì)自由探索裝置陌生區(qū)和熟悉區(qū)有不同偏好，進(jìn)而佐證自由探索實(shí)驗(yàn)可用于檢測小鼠特質(zhì)焦慮程度，但未見有應(yīng)用自由探索實(shí)驗(yàn)檢測不同品系大鼠特質(zhì)焦慮水平的報(bào)道。事實(shí)上這種基于大鼠不同遺傳背景的特質(zhì)焦慮水平差異可為自由探索實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠特質(zhì)焦慮提供更為充足的行為學(xué)證據(jù)。如果有足夠?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)表明不同品系大鼠對(duì)自由探索裝置陌生區(qū)和熟悉區(qū)偏好程度不同，而高架十字迷宮、曠場等檢測狀態(tài)焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果間并無明顯差異，則論證自由探索實(shí)驗(yàn)可用于檢測大鼠特質(zhì)焦慮水平無疑更具有說服力。

自由探索實(shí)驗(yàn)的基本原理是制造一種特定應(yīng)激場景讓動(dòng)物遭受探索-恐懼的沖突心理體驗(yàn)，其基本內(nèi)核與高架十字迷宮、曠場、洞板實(shí)驗(yàn)[35-38]等并無明顯區(qū)別。眾所周知，以上提及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮、抑郁等多種情緒，則一個(gè)明顯的推論是自由探索實(shí)驗(yàn)可否用于評(píng)價(jià)動(dòng)物其他特質(zhì)情緒，如特質(zhì)抑郁或特質(zhì)怒？如果可用于評(píng)價(jià)其他特質(zhì)情緒則各類特質(zhì)情緒間又當(dāng)如何區(qū)別？

特質(zhì)焦慮與狀態(tài)焦慮相關(guān)性如何？前文已提到特質(zhì)焦慮和狀態(tài)焦慮間的聯(lián)系與區(qū)別，則兩者相關(guān)性究竟如何也是研究者感興趣的科學(xué)問題。從理論角度講，這似乎不是一個(gè)問題，一般認(rèn)為高特質(zhì)焦慮的個(gè)體相比低特質(zhì)焦慮的個(gè)體面臨危險(xiǎn)和威脅的情況時(shí)會(huì)呈現(xiàn)更頻繁、力度更強(qiáng)烈的狀態(tài)焦慮反應(yīng)。然而，這種觀點(diǎn)是否適用于動(dòng)物模型？可以假設(shè)動(dòng)物在自由探索實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)出高焦慮水平，在高架十字迷宮中同樣會(huì)顯現(xiàn)出高焦慮水平，那么兩個(gè)模型獲得的結(jié)果就會(huì)呈線性正相關(guān)，這一假說的檢驗(yàn)也有助于研究者更好地認(rèn)識(shí)特質(zhì)焦慮與狀態(tài)焦慮[40]的區(qū)別。

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