MRSA的spa、clfB及spa-clfB雙位點序列分型的研究進展

劉曄華(綜述)，穆 紅(審校)

(天津市第一中心醫院檢驗科，天津 300192)

1959年，甲氧西林用于治療青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染。1961年，在英國即分離到耐甲氧西林的MRSA，隨后歐洲其他國家也分離出MRSA，之后在日本、澳大利亞和美國分離出該菌。目前MRSA正在全世界快速蔓延，所致感染可呈散發、流行、甚至暴發[1-2]。MRSA的感染已成為全球公共衛生問題之一。

迄今為止，已對MRSA進行了從表型分析(比如噬菌體分型)到基因組分型——脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)的一系列研究[3]，最近基于單個基因或基因聯合運用的分型技術有很大發展，該技術的優點在于通過基因分型所建立的數據庫具有在不同實驗室間的可比性，通過公用網站對所得數據資料歸納匯總，對暴發流行株進行親緣鑒定和克隆群區分，以發現新的型別。

1 MRSA的基因組構成

MRSA的基因組可分為核心基因和附屬基因兩個部分，其核心基因主要包括7個看家基因(arcC、aroE、glpE、gmk、pta、tpi、yqiL)，這些基因進化相對緩慢，主要通過點突變和基因置換完成進化，因此相對穩定。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的方法是基于上述450～500 bp的7個看家基因的等位基因不同型別的分子分型技術[4]，這種方法可在全球范圍內對MRSA進行克隆群體的區分，以便進一步對所調查的菌株溯源。MRSA的附屬基因包括mecA毒力因子(sea、tst和eta等)和黏附基因家族成員(clfA、clfB、fnbA、fnbB、spa等)[5]，這類基因可在菌株間傳遞，其所編碼蛋白與細菌的表型相關(圖1)?？傮w上說，MLST分型可以了解特定地區MRSA的群體結構，即哪個克隆群占優勢；基于附屬基因的分型方法更適合特定地區MRSA的流行病學監測，但兩類方法需聯合運用以互補。

圖1 金黃色葡萄球菌基因結構圖

2 MRSA的分型方法

2.1spa基因分型 MRSA spa基因序列全長1527 bp，是編碼509個氨基酸的A蛋白，該蛋白是MRSA細胞壁的組成部分。spa基因從5′端到3′端依次為信號序列S、IgG結合區域A～D(E區域和A～D同源)、X可變重復區域(圖2)，其中Xr區由24 bp重復序列串聯組成，點突變形成了重復序列的多個型別，而重復序列的插入或缺失構成了Xr區長度以及串聯圖譜的多態性，到目前為止spa的重復序列已達581個[6]，這可以確保該分型方法的靈敏度和分型能力。在X區域上游的C末端存在高度保守性的開放讀碼框，可對X區域進行聚合酶鏈反應以便對不同菌株進行基因分型，已經有公共網站進行分型比對(http://spa.ridom.de/spaserver)。

圖2 spa的基因結構(從左到右5′～3′)

最早應用spa分型技術的是Frénay等[7]，他們以14株已公布全基因組序列的MRSA作為對照，測定了33株MRSA spa基因X區串聯重復序列，認為流行株X區串聯重復序列相對較長，這有助于細菌與IgG的Fc段結合。隨后Shopsin等[8]從散發流行到暴發流行的角度對spa分型技術進行了全面評價，并公布了spa重復序列的型別以及編碼方式，使得該技術得到進一步應用。2003年Harmsen等[9]研發了spa分型軟件并創建了公共網站，通過上傳各地區MRSA spa的串聯重復序列測序結果，即可得到相應型別；隨后該網站完善了對MRSA的spa型別歸納匯總，類似對MLST分型結果進行CC克隆群體的親緣鑒定，同時該網站可以將spa的分型結果與MLST分型結果進行對應，彌補了單一分型方法的局限性(http://spa.ridom.de/mlst.shtml)。大量的研究報道指出，spa分型技術不如PFGE敏感，但優于MLST的分型能力[10-13]。因此，應對區域性MRSA的暴發流行調查或短期內該菌的流行病學調查，spa分型是一種簡單易行的方法[14-16]。

2.2clfB基因分型 clfB基因與spa基因相似，MRSA的clfB是黏附素基因家族成員之一[17]，由其編碼的凝集因子B可錨定于人類纖維蛋白和角蛋白上，繼而使MRSA定植于人類鼻咽部，因此clfB在MRSA的致病機制中發揮著重要作用。有報道稱，clfB在MRSA所致的心內膜炎中發揮病理作用[18]。clfB基因含有420～804 bp的絲氨酸-天冬氨酸(serine-aspartate，SD)高度變異串聯重復序列，該SD序列由18 bp(TCN-GAY-TCN-GAY-AGY-GAY，其中N=A、C、G或T、Y=C或者T)組成(圖3)，由于核苷酸突變以及發生于復制階段的鏈錯配致使SD序列增加或丟失，使得該區域具有遺傳多態性。clfB具有體內、外穩定性及宿主之間傳播的穩定性，且clfB為毒力基因，易受進化選擇壓力的影響，加之SD序列的高度變異性保證了clfB分型的高分辨率，因此可以作為MRSA分型的候選基因[17,19]。已知clfB的SD序列有102個不同的型別，依據應用spa串聯重復序列分型的原理，也可應用clfB的SD序列對MRSA進行分型。依據該基因的病理作用，將有助于區分感染株和定植菌株。

最早應用clfB進行分型的報道來自美國新澤西醫學院的Koreen等[19]的研究組和洛克菲勒大學Gomes等[20]的研究組對MRSA所做的clfB分型，結果顯示其分型能力僅次于PFGE，優于spa和MLst的分型能力，而且與PFGE和spa分型的一致性>95%。

圖3 clfB的基因結構

Ugolotti等[21]研究人員在Koreen等[19]的基礎上對clfB分型方法做了改進，相應法則如下：如果clfB重復序列的圖譜具有相同的5′和3′端，則歸入同一系列，同一系列內的亞類通過罰分法則區分，其中插入、不連續缺失以及18 bp重復序列被12 bp序列置換各有相應罰分，最終累計分數可區分不同亞類：1=A<2；2=B<3；3=C<4；4=D<5；5=E<6；6=F<7；7=G<9；9=H<11；L>=11。不同的系列用不同羅馬數字表示。

2.3spa-clfB雙位點基因分型 研究認為，單純應用spa分型、clfB分型不及PFGE的分型能力，但PFGE對同一菌株在體外傳代或保存幾個月后再進行分型，其結果即可能改變[17,22]，加之PFGE操作費時，至今尚未建立針對其分型的一致判別標準，故該方法不能在不同實驗室間進行比對。Kuhn等[10]將spa與clfB聯合應用，即雙位點序列分型(double-locus sequence typing，DLST)，這既分析了spa和clfB全部重復序列的圖譜，也分析兩者自3′端500 bp重復序列圖譜。聯合分型的分型能力與PFGE相當，且更加經濟省時。許多專家研究證實，spa和clfB這兩個候選基因具有體內外穩定性強，不易發生遺傳突變的特點[6,19]。Basset等[23]的研究組應用DLST分型技術對186株甲氧西林敏感MRSA和103株MRSA進行分型，獲得了205個DLST基因型，分型指數(index of discrimination,ID)為0.994。Ugolotti等[21]應用DLST技術對一家醫院的ICU、外科和急診科室進行了3年的流行病學調查，查明了幾個科室MRSA的主要流行株，與PFGE相比，DLST簡便、重復性好，ID達到0.85，優于spa(ID=0.58)和clfB(ID=0.83)。

3 小 結

MRSA基因組可分為核心基因和附屬基因兩部分，基于核心基因的分型包括MLST分型，基于附屬基因的分型包括spa分型、clfB分型以及spa-clfB雙位點基因分型等。MLST分型可了解特定地區MRSA的群體結構，即哪個克隆群占優勢；spa分型、clfB分型及spa-clfB雙位點基因分型更適合特定地區MRSA的流行病學監測。簡而言之，對于MRSA的分型，不論是PFGE、MLST，還是依據于附屬基因(如spa、clfB分型等)的可變串聯序列分型，任何一種方法的分型能力都存在局限性，因此需聯合應用幾種分型方法，并結合流行病學資料，才能做到準確溯源。

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