PLGF、Flt-1與妊娠期高血壓疾病的相關性研究

王 芳，郭鳳嬋

(1.河北大學附屬醫院婦產科,河北 保定 071000； 2.河北醫科大學第三醫院婦產科,石家莊 050051)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的多臟器損傷性疾病。該病嚴重影響母嬰健康，是孕產婦和圍生兒死亡的主要原因，發病率為7%～12%[1]。近年來的研究表明，胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF)與妊娠期高血壓疾病的關系密切。本研究檢測妊娠期高血壓疾病患者PLGF和膜型血管內皮生長因子受體1(Flt-1)蛋白在胎盤中的表達，探討PLGF及其受體與妊娠期高血壓疾病發病的關系及其相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2008年1月至2010年1月河北大學附屬醫院等多家醫院婦產科收治的未發動宮縮即行剖宮產的孕婦60例為研究對象，其中妊娠期高血壓疾病40例(輕度子癇前期組20例、重度子癇前期組20例)，年齡23～37(27±4)歲，孕周28+3～39+4(36±3)周；正常妊娠組20例，年齡22～36(26±3)歲，孕周33～41(36.6±0.7)周。各組孕婦均無肝炎、結核等急、慢性傳染病史，無高血壓病、腎病及心臟病史，無貧血、無巨大兒及胎兒生長受限的發生。三組孕婦的年齡和孕周等一般資料具有均衡性。

1.2儀器和試劑

1.2.1試劑 胎盤Flt-1水平的測定：一抗為Flt-1兔抗人單克隆抗體，由武漢博士德生物公司提供；二抗為葡聚糖-過氧化物酶復合物，由北京中杉生物公司提供.

1.2.2儀器 自動洗板機(芬蘭，Labsystems Dragon公司，4MKZ型)，脫水機、包埋機、切片機(英國姍頓公司，Citadel2000)，微波儀(浙江臨安電子儀器廠，TMY-781B)，顯微鏡(日本，BHS，Olympus)，冰箱(中國青島海爾集團，SC-278L)，加樣器(上海醫用激光儀器廠，25 μL)載玻片(鹽城市耀華玻璃儀器廠，26 mm×76 mm)，圖象分析儀(華東理工大學自動化研究所，Version2.0)。

1.3方法

1.3.1胎盤PLGF水平的測定 采用免疫組織化學法進行檢測：①從已經平衡至室溫的密封中取出所需條板；②分別加入標本及不同濃度標準品(100 μL/孔)，空白孔加標準品稀釋液(100 μL/孔)，用封板膠封住反應孔，37 ℃孵育2 h；③自動洗板機洗板4次；④加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用封板膠封住反應孔，37 ℃孵育90 min；⑤自動洗板機洗板4次；⑥加入酶結合物稀釋液(100 μL/孔，空白孔不加)，用封板膠封住反應孔，37 ℃孵育90 min；⑦自動洗板機洗板5次；⑧加入顯色劑(100 μL/孔)，室溫避光孵育10～15 min；⑨加入終止液(100 μL/孔)，混勻后即刻用酶標儀測量OD450值(5 min內)。

1.3.2胎盤Flt-1蛋白表達水平的測定 采用免疫組織化學法進行檢測：①脫蠟至蒸餾水；②3%過氧化氫甲醇液室溫浸泡10～15 min，消除內源性過氧化物酶活性；③抗原修復用高壓鍋法冒氣2 min；④滴加1%小牛血清白蛋白封閉液，室溫孵育10～15 min(封閉組織內電荷)，傾去血清，不洗片；⑤滴加一抗兔抗人Flt-1單克隆抗體(效價1∶50)，置于濕盒中4 ℃冰箱過夜；⑥磷酸緩沖液振洗3次，每次5 min；⑦滴加二抗PV6001葡聚糖-過氧化物酶酶復合物，37 ℃孵育60 min；⑧磷酸緩沖液振洗3次，每次5 min；⑨滴加二氨基聯苯胺顯色劑：磷酸緩沖液4 mL，二氨基聯苯胺5 g，H2O 25 μL，顯色10 min左右；⑩蒸餾水充分沖洗5次；(11)蘇木素復染1 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片；(12)光鏡下觀察結果。

1.4判定方法

1.4.1胎盤PLGF結果的判定 按顯微鏡下切片所見細胞無棕黃陽性顆粒或呈一致黃色與背景一致為0分；核內或漿內可見少量淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；核內或漿內可見較多淡黃色顆粒為2分；核內或漿內可見較多淡黃色顆粒為3分[2]。

1.4.2胎盤組織Flt-1染色評分的判定 胎盤組織染色陰性記1分，弱陽性記2分，陽性記3分，強陽性記4分[2]。

2 結 果

2.1各組受試者胎盤組織中PLGF檢測結果的比較 妊娠期高血壓疾病的PLGF評分顯著低于正常妊娠組，隨病情加重PLGF有下降趨勢，重度子癇前期組<輕度子癇前期組<正常妊娠組(P<0.05)；三組受試者胎盤組織中PLGF評分的比例比較差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2各組受試者胎盤組織Flt-1免疫組化染色評分的比較 Flt-1蛋白在妊娠期高血壓疾病胎盤中的評分隨病情加重呈下降趨勢(P<0.05)，重度子癇前期組<輕度子癇前期組<正常妊娠組；三組受試者胎盤組織中Flt-1免疫組織化學染色評分的比例比較差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

2.3各組受試者胎盤組織Flt-1表達定量分析的結果比較 病理彩色圖像分析儀對Flt-1蛋白的表達進行平均灰度圖像分析結果顯示：不同程度的妊娠期高血壓疾病組與正常妊娠組相比平均灰度隨病情加重有降低趨勢，重度子癇前期組<輕度子癇前期組<正常妊娠組(P<0.05)(表3)。

表1 各組受試者胎盤組織PLGF檢測結果的比較

PLGF：血管內皮生長因子1；a：與正常妊娠組比較,q=5.17,5.63，P<0.05；b：與子癇前期輕度組比較，q=6.11，P<0.05

表2 各組受試者胎盤組織Flt-1免疫組織化學染色結果的比較

PLGF：血管內皮生長因子1；a：與正常妊娠組比較,q=14.13,14.47，P<0.05；b：與子癇前期輕度組比較，q=10.46，P<0.05

表3 各組受試者胎盤組織Flt-1表達定量分析

PLGF：血管內皮生長因子1；a：與正常妊娠組比較,q=3.17,3.35，P<0.05；b：與子癇前期輕度組比較，q=4.27，P<0.05

3 討 論

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，是威脅母嬰健康最常見的一種疾病，發病率可高達10%左右，是目前導致我國孕產婦死亡的第二位死因[3]。

妊娠期高血壓疾病的發病機制尚不明確，但胎盤缺血缺氧血管內皮損傷學說被廣泛接受[4]。PLGF是血管內皮生長因子的一種，有不同蛋白質亞型[5]，其作用包括促使血管內皮細胞的增生、遷徙和激活，促使血管生成和形成[6]。研究表明，血管內皮細胞損傷和胎盤淺著床是妊娠期高血壓疾病發病的中心環節[7]，甚至有學者將妊娠期高血壓疾病視為血管內皮損傷性疾病[8]。

本研究結果顯示,妊娠期高血壓疾病各組患者胎盤組織PLGF評分顯著低于正常妊娠孕婦，并隨著病情加重有逐漸下降趨勢，推測妊娠期高血壓疾病患者可能由于胎盤缺血缺氧，使滋養細胞形態和功能發生改變，并引起PLGF分泌下調，而較低的PLGF 水平又影響妊娠期高血壓疾病患者絨毛外滋養細胞增殖和浸潤能力，使血管生成和形成受阻，導致胎盤血管重構障礙，使胎盤缺血缺氧進一步發展。

本試驗對胎盤組織Flt-1定位研究結果顯示：Flt-1蛋白是血管內皮生長因子高親和性受體之一，廣泛存在于血管內皮細胞和滋養細胞等[9]。Flt-1在胎盤絨毛主要表達于滋養細胞和血管內皮細胞，間質細胞散在表達，表達部位在胞膜、胞質[10]。胎盤免疫組織化學分析結果顯示，妊娠期高血壓疾病胎盤組織中Flt-1評分顯著低于正常妊娠孕婦，并隨病情的加重有降低的趨勢，推測Flt-1降低，影響了滋養葉細胞的分化與增殖，其分化異常使細胞與細胞、間質的反應減弱，限制了滋養葉細胞的侵潤能力，造成滋養葉細胞侵入缺陷，使胎盤淺著床，胎盤絨毛缺血、缺氧，而下調的Flt-1和PLGF與血管內皮生長因子結合力下降，使血管內皮的完整性受損，影響胎盤血管的形成，造成胎盤血流減少，進一步損傷了血管內皮細胞的功能，從而產生小動脈痙攣等一系列典型妊娠期高血壓疾病的病理變化。

綜上所述，PLGF、Flt-1在妊娠期高血壓疾病發病機制中起重要作用，若能動態觀察PLGF、Flt-1的變化，有可能對妊娠期高血壓疾病的治療起重要指導作用。

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