羅格列酮對糖尿病大鼠腎臟Smad7、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達的影響及意義

陳寬林，方明明，張玉穎，張麗莉

(江蘇建康職業學院 1內科教研室， 2教務處，南京 210029)

糖尿病腎病是糖尿病常見慢性并發癥，研究顯示與高血糖所致相關炎性因子導致腎臟轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)合成增加，誘導成纖維細胞過度增殖、膠原高表達有關，并且通過Smads家族介導[1]。羅格列酮因其可能誘發或加重心力衰竭而曾備受爭議，但最新研究證實其在無基礎心臟疾病的糖尿病患者中應用的安全與可靠性，而且還可以抑制糖尿病腎病發生與發展[2]。為了進一步了解羅格列酮在糖尿病腎病發病機制中的作用，本研究觀察了羅格列酮對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病SD大鼠腎臟Smad7、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達，以及糖基化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c，GHbA1c)水平，以觀察和探討羅格列酮對糖尿病大鼠腎臟保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1動物 鼠齡3個月左右SD雄性大鼠若干(購自南京盛名科研動物中心，清潔級)，體質量210～250 g，對其先行室溫、自然光下正常飼養1周，以0.1 mmol/L、pH4.8無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)配置濃度為2%的鏈脲佐菌素注射液，按照60 mg/kg體質量進行一次性腹腔注射，分別在注射后24 h和48 h兩次測量尾靜脈血糖，連續兩次血糖水平在16.7 mmol/L以上者作為實驗性糖尿病大鼠成功模型。選擇制模成功的20只大鼠隨機分為羅格列酮組10只，生理鹽水對照組10只。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器

1.2.1.1試劑 Smad7(編號BA1399)、TGF-β1(編號BA0290)、Ⅳ型膠原(編號BA2174)免疫組織化學試劑，即用鏈霉親和素-生物素復合物(streptavidin biotin complex，SABC)(編號SA1025)、5%小牛血清蛋白封閉液、生物素標記二抗(以上試劑為SABC配套試劑盒)、二氨基聯苯胺(編號AR1022)顯色劑等試劑盒均購自武漢博士德(Boster)生物工程有限公司；大鼠GHbA1c免疫酶聯吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測試劑購自上海恒遠生物科技有限公司(編號HY22591E)；鏈脲佐菌素購自Sigma公司(編號S-0130)；臨床用羅格列酮片由成都恒瑞制藥有限公司生產(批準文號：國藥準字H20036509，生產日期2010/06/02)；0.1 mmol/L PBS(分析純)、去離子水、30%雙氧水(分析純)。

1.2.1.2儀器設備 萊卡切片機(UC07，德國徠卡儀器公司生產)，雙目鏡奧林巴斯光學顯微鏡(CX31，日本奧林巴斯光學顯微鏡公司生產)，酶標儀(Bio-Rad 750，美國BIO-RAD伯樂生產)，烤箱，低溫冰箱，微波爐等。

1.2.2動物處理 以注射用生理鹽水為溶劑配置濃度為0.2 g/L羅格列酮，每日1次定時稱重后羅格列酮組按1 mg/kg體質量羅格列酮灌胃，生理鹽水對照組以與體質量相對應劑量生理鹽水灌胃。實驗期間，常規喂飼大鼠專用飼料、常溫下飼養。給藥期滿后，以提拉頸椎法處死大鼠，立即剖腹取適當大小腎臟標本經4%PBS甲醛充分固定，石蠟包埋。

1.2.3切片染色及免疫組織化學法測定 切片厚度4 μm，免疫組織化學實驗過程及步驟嚴格按相關試劑說明書要求進行，現用現配3%新鮮雙氧水，采用免疫組織化學專用復合消化酶法修復抗原。所有切片均經蘇木素輕度復染后透明，中性樹脂蓋玻片封片。

1.2.4切片觀察及數據采集 本實驗觀察指標均采用生物素標記、二氨基聯苯胺顯色法顯色，指標陽性結果顯色均為棕(黃)色。所有切片在10×20鏡下選擇5個視野攝片，經由Image-Pro Plus6圖像分析軟件分析平均陽性面積率。

1.2.5大鼠GHbA1c測定 采用ELISA法檢測大鼠血漿GHbA1c，450 nm波長讀數。

2 結 果

2.1組間各指標陽性表達 兩組間Smad7、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達免疫組織化學陽性表達結果分別見圖1、圖2及圖3(圖見封三)。圖片中棕色或棕褐色者為各指標的陽性表達。圖1顯示兩組Smad7表達，羅格列酮組陽性表達率顯著高于生理鹽水對照組；圖2顯示兩組TGF-β1表達，羅格列酮組陽性表達率顯著低于生理鹽水對照組；圖3顯示兩組Ⅳ型膠原表達，羅格列酮組陽性表達率顯著低于生理鹽水對照組。

2.2組間指標統計結果 兩組間各項對應指標方差齊性檢驗結果顯示，組間指標方差齊性一致(P均>0.05)。兩組的Smad7表達陽性面積百分率比較，羅格列酮組的表達顯著高于生理鹽水對照組(P<0.01)；兩組TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達陽性面積百分率比較，羅格列酮組的表達均顯著低于生理鹽水對照組(P<0.01)；兩組的GHbA1c水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組糖尿病大鼠腎各觀察指標表達陽性面積百分率對數統計分析結果 (%)

TGF-β1:轉換生長因子β1；GHbA1c：糖基化血紅蛋白A1c

2.3組內指標相關性 組內各指標間相關關系統計比較結果見表2。兩組內Smad7與TGF-β1、Ⅳ型膠原之間呈負性相關，TGF-β1與Ⅳ型膠原表達呈正性相關，但均無統計學意義(P>0.05)。

表2 糖尿病大鼠腎組內指標相關關系分析結果 [RR(P)]

TGF-β1:轉換生長因子β1；“-”：自身對照，未做相關性分析

3 討 論

糖尿病腎病基本病理改變在于腎小球基質膠原代謝紊亂，尤其Ⅳ型膠原是糖尿病腎病基質增生的主要成分。實驗表明，Ⅳ型膠原的代謝受TGF-β1介導調控：TGF-β1促進Ⅳ型膠原合成，此作用可被抗TGF-β1抗體抑制；同時TGF-β1具有抑制蛋白水解酶合成、刺激蛋白水解酶抑制物產生[3-4]。TGF-β所介導上述纖維化均通過Smad信號通路轉導，Smad蛋白是目前所知的唯一TGF-β受體的胞內激酶底物，介導了TGF-β胞內信號轉導。TGF-β1信號轉導經由Smad完成，作為TGF-β受體系統下游信號轉導分子有三種：調節型Smad、輔助型Smad、抑制性Smad。磷酸化后的調節型Smad，結合型輔助型Smad或抑制型Smad進入核內，與DNA結合伴侶作用于相應基因，如Ⅳ型膠原和相關的分解酶基因，調節其轉錄和表達，使得Ⅳ型膠原的合成增加而分解減少，導致腎小球系膜細胞外和腎小管間質的基質增加。

內源性Smad7的表達是TGF-β致纖維化作用的一個關卡：只有通過它才能出現致纖維化反應。Li等[5]研究發現，正常大鼠腎小管上皮細胞和腎小球系膜細胞在高糖刺激后TGF-β1上調，Smad信號通路被激活，Smad2和Smad3發生磷酸化并移位至細胞核內，同時Ⅰ型膠原的合成增加。Smad7可明顯抑制高糖誘導的系膜細胞和腎小管上皮細胞Smad2、Smad3活化及Ⅰ型膠原合成，下調Smad3表達可以抑制TGF-β1誘導的細胞生長[6]，應用Smad2/3阻斷劑Smad7和聯蛋白素連接激酶阻斷劑可阻斷上皮間充質轉化和減輕腎臟纖維化[7]，剔除Smad7基因的鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠腎小球基質Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的水平顯著增加[8]。這些研究都進一步表明TGF-β1/Smad信號通路是導致進展性腎小管間質纖維化的關鍵通路，腎纖維化受Smad2和Smad3的正向調節和Smad7的負向調節。

本實驗結果顯示，羅格列酮組Smad7表達率顯著高于生理鹽水對照組，TGF-β1、Ⅳ型膠原表達率顯著低于生理鹽水對照組，說明羅格列酮不但通過上調Smad7表達抑制TGF-β1誘導的Ⅳ型膠原增殖作用，同時具有抑制TGF-β1表達功能，而兩組間GHbA1c水平的差異并無統計學意義。因此，上述結果與羅格列酮降糖作用似無關聯，是否與其通過抑制其他炎性因子和糖尿病氧化應激而抑制TGF-β1表達尚待進一步研究。盡管羅格列酮因其可能增加臨床心力衰竭的風險而備受爭議，但動物實驗結果顯示羅格列酮長期使用不但沒有增加心力衰竭風險，相反有助于改善合并心力衰竭大鼠腎臟對水鹽調節[9-10]。Arora等[2]實驗表明，羅格列酮能夠阻止實驗性糖尿病大鼠腎病進展，本組實驗羅格列酮具有通過調節實驗性糖尿病大鼠腎臟Smad7、TGF-β1表達影響腎臟Ⅳ型膠原表達，抑制基質纖維化，具有保護糖尿病腎臟作用。

[1] Blanchette F,Rudd P,Grondin F,etal.Involvement of Smads in TGF-beta1-induced furin (fur) transcription[J].J Cell Physiol,2001,188(2):264-273.

[2] Arora MK,Reddy K,Balakumar P.The low dose combination of fenofibrate and rosiglitazone halts the progression of diabetes-induced experimental nephropathy[J].Eur J Pharmacol,2010,636(1/3):137-144.

[3] Ziyadeh FN,Sharma K,Ericksen M,etal.Stimulation of collagen gene expression and protein synthesis in murine mesangial cells by high glucose is mediated by activation of transforming growth factor-beta[J].J Clin Invest,1994,93(2):536-542.

[4] Slernberg M,Cohen-Fotere L,Peyroux J,etal.Connective tissue in diabetes mellitus:Biochemical alternations of the extracellular matrix with special reference to proteoglycans,collagens and basement membranes[J].Diabet Metab,1985,11(1):27-50.

[5] Li JH,Huang XR,Zhu HJ,etal.Role of TGF-β signaling in extracellula matrix production under high glucose conditions[J].Kidney Int,2003,63(6):2010-2019.

[6] Nicolas FJ,Lehmann K,Warne PH,etal.Epithelial to mesenehymal transition in Madin-Darby can ine kidney cells is accompanied by downregulation of Smad3 expression,leading to resistance to transforming growth factor-beta-induced growth arrest[J].J Biol Chem,2003,278(5):3251-3256.

[7] Li Y,Yang J,Dai C,etal.Role for integrin-linked kinase in mesenchemal tubular epithelial to mesenchymaltransition and renalinterstitialfibrogenesis[J].J Clin Invest,2003,112(4):503-516.

[8] Chen HY,Huang XR,Wang W,etal.The protective role of Smad7 in diabetic kidney disease:mechanism and therapeutic potential[J].Diabetes,2011,60(2):590-601.

[9] Wilson SM,Mansley MK,Getty J,etal.Effects of peroxisome proliferator-activated receptor γ agonists on Na+transport and activity of the kinase SGK1 in epithelial cells from lung and kidney[J].Br J Pharmacol,2010,159(3):678-688.

[10] Goltsman I,Wang X,Lavallie ER,etal.Effects of chronic rosiglitazone treatment on renal handling of salt and water in rats with volume-overload congestive heart failure[J].Circ Heart Fail,2011,4(3):345-354.