人型支原體ParE基因突變與耐氟喹諾酮類藥物的關系

羅永慧，段穎卿，甘雪華，王旭菲，舒向榮

(江西省婦幼保健院，江西 南昌330008)

人型支原體(Mycoplasma hominis，Mh)是泌尿生殖道感染的常見病原體[1，2]。氟喹諾酮類藥物因具有較強的抗支原體活性而廣泛應用于支原體感染的臨床治療。但近年來,Mh對該類藥物的耐藥性日益增加。本實驗通過設計針對Mh拓撲異構酶ⅣParE基因的特異性引物,對耐氟喹諾酮類藥物Mh株ParE基因所編碼的氨基酸序列進行分析，了解本地區臨床Mh株ParE基因突變與耐氟喹諾酮類藥物的關系，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取從泌尿生殖道分泌物中分離的8株對4種氟喹諾酮類藥物呈不同耐藥的Mh為研究對象。Mh的培養、鑒定、藥物敏感性試驗判斷方法見操作說明,所用試劑為珠海迪爾生物公司產品。

1.2 儀器與試劑 電泳儀、電泳槽系美國BIORAD公司產品，PCR儀系珠海黑馬醫學儀器有限公司產品。PCR系列試劑、DNA marker為New England Biolabs公司產品。

1.3 檢測方法

1.3 .1引物設計和合成 采用Bebear等[3]設計的一對引物，ParE基因的上游引物為 5′-CTTTCAGGAAAATTAACTCCT-3′，下游引物為 5′-ATCAGTGTCAGCATCTGTCAT-3′,引物由上海生工公司合成。

1.3 .2耐藥菌株DNA模板制備 取耐藥菌株培養物500μl，12000r/min離心20min,棄上清液，沉淀物中加入標本裂解液，100℃水浴 10min，12000r/min離心5min后取上清液作為DNA模板。

1.3 .3 ParE-PCR擴增 將dNTP、MgCl2、 上下游引物、模板DNA和DNA聚合酶分別加入到反應管中，反應體系50μl，充分混勻后行PCR擴增。擴增條件為92℃預變性10min后進入循環，92℃60s,57℃60s,72℃120s, 共 40個循環后再 72℃450s，終止反應。取擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，保存擴增產物備用。

1.3 .4序列測定及基因序列比對 PCR擴增后的目的片段經回收、純化后，以PE公司產的ABI310型自動測序儀測DNA序列。所測序列與野生株MHPG21的ParE基因核苷酸序列進行比對。

2 結果

2.1臨床分離的Mh菌株對氟喹諾酮類藥物的藥敏結果 采用肉湯稀釋法檢測臨床分離的Mh對4種氟喹諾酮類藥物的藥敏結果，并對這些菌株的耐藥表型與ParE基因所編碼的氨基酸殘基變異進行分析，結果見表1。

表11 MM hh菌株對44種氟喹諾酮類藥物的藥敏結果及ParE基因編碼的氨基酸變異

2.2 ParE基因擴增產物經PCR擴增后獲得Mh菌株ParE基因片段經瓊脂糖凝膠電泳，在約297bp處有特異性擴增條帶 ，與引物預期擴增產物相符合,結果見圖1。

圖1 ParE基因擴增產物

2.3 ParE基因擴增產物測序 將ParE-PCR擴增產物測序，測序結果經PUBMED數據庫對比分析，臨床所分離的Mh耐藥株中，有6株檢出對應于野生株 (PG21)ParE基因所編碼氨基酸序列426位D(Asp天冬氨酸)轉變為N(Asn天冬酰胺)。

3 討論

氟喹諾酮類藥物因具有較強的抗支原體活性而廣泛應用于支原體感染的臨床治療，其機理主要是作用于支原體DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，通過阻止DNA復制、修復、染色體的分離、轉錄及其他功能，達到殺菌的目的。DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ分別由GyrA、GyrB和ParC、ParE兩組基因編碼。這兩組基因若發生變異，相應氨基酸改變，導致靶酶改變，將阻止氟喹諾酮類藥物進入作用區，從而產生耐藥性。

對Mh耐氟喹諾酮類藥物的分子機制研究，國內外報道主要是體外篩選誘導耐藥株，并對相關基因所編碼的氨基酸序列進行分析，以發現耐藥相關性氨基酸變異。國內對GyrA基因變異與Mh耐氟喹諾酮類藥物的相關性報道較多，而對Mh臨床分離株ParE基因變異與其耐氟喹諾酮的相關性研究甚少[4，6]。Bebear等[3]率先對 Mh 參考株 PG21的拓撲異構酶Ⅳ亞單位ParC和ParE基因進行克隆并測序。隨后作了系統的研究，對Mh參考株PG21進行體外藥物誘導，然后檢測篩選株中GyrA、GyrB和ParC、ParE基因的變異情況，研究說明了DNA螺旋酶是司帕沙星作用的原始靶位,而拓撲異構酶IV是氧氟沙星、環丙沙星和培氟沙星作用的原始靶位。對于Mh臨床分離株的檢測,研究顯示除GyrA基因變異外，同樣存在ParC和ParE基因的變異[7]。張冉等[8]將MHPG21藥物誘導后進行ParE基因突變檢測，發現誤義突變主要存在70位的G→A，導致其編碼的426位天冬氨酸被天冬酰胺取代；提示ParE基因中的點突變可能是耐藥機制的一部分。

本研究中對氧氟沙星、左氧氟沙星和環丙沙星多種藥物耐藥或中介的6株Mh臨床分離株中檢出ParE基因所編碼的氨基酸426位D(Asp天冬氨酸)轉變為N(Asn天冬酰胺),這一突變與以往報道的對Mh誘導株和臨床分離株結果相一致[8,9]；還有2株未檢測出氨基酸變異，其耐藥性可能與別的耐藥機制有關；結果表明本地區的Mh臨床流行耐藥株的耐藥性可能與ParE基因所編碼的氨基酸殘基發生D426→N變異有關。氨基酸變異導致的耐藥可能為取代的氨基酸與被取代的氨基酸所帶電荷不同,極性上有差別,或結構相差較大,或羥基殘基丟失等,使得相應蛋白酶的空間結構改變,影響了酶與氟喹諾酮類藥物的結合。

總之，正確認識人型支原體耐氟喹諾酮類藥物的發生機制,對臨床合理選用抗生素,減少耐藥性的發生,有效控制支原體感染具有重要意義。

[1]白衛君,曹愛華,王立麗,等.泌尿生殖道支原體感染及藥敏結果分析[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(5):467-469.

[2]鄭勇,高緒鋒,張松濤,等.680例女性泌尿生殖道支原體和沙眼衣原體感染及耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(1):65-66.

[3]Bebear CM,Renaudin H,Charron A,et al.Alterations in topoisomerase IV and DNA gyrase in quinolone-resistantmutants of My coplasma hominis obtained in vitro [J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(9):2304-2311.

[4]葉萍,鄧超干,王輝,等.體外獲得性人型支原體氟喹諾酮耐藥株GyrA基因研究[J].中國熱帶醫學,2009,9(3):435-436.

[5]向斌,吳移謀,尹衛國,等.人型支原體gyrA基因突變與耐喹諾酮類藥物的關系[J].中華皮膚科雜志,2000,33(3):169-170.

[6]孟冬婭,王璐,馬均,等.人型支原體對喹諾酮類藥物耐藥機制的初步研究[J].中國皮膚性病學雜志,2010,24(11):997-999.

[7]Bebear CM,Renaudin J,Charron A,et al.Mutations in the gyrA,parC,and parE genes associated with fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Mycoplasma hominis[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(4):954-956.

[8]張冉,吳移謀,向斌,等.喹諾酮類藥物誘導人型支原體耐藥機理研究[J].中華檢驗醫學雜志,2000,23(5):273-275.

[9]于靜波,王璐,張明磊,等.人型支原體拓撲異構酶IV氨基酸變異與喹諾酮耐藥關系的研究 [J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(16)：1792-1793.