嬰幼兒感染豬霍亂沙門菌耐藥基因特點及同源性分析

黃凱，余曉君，王曄

(江西省兒童醫院檢驗科，江西 南昌330006)

沙門菌是一種重要的腸道病原菌，主要通過污染的食物、飲用水經口感染進入消化道致病，常引起小范圍內的流行。其中豬霍亂沙門菌是引起嬰幼兒腸道感染最常見的致病血清型，為了解本地區豬霍亂沙門菌嬰幼兒血流感染的流行及耐藥的分子特點，本文收集我院2008年至2011年間分離自不同病區患兒血液中的豬霍亂沙門菌16株，同時對其進行耐藥基因檢測及同源性分析，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及耐藥特點 16株豬霍亂沙門菌均分離自2008年7月至2011年8月我院不同病區各個患兒血液標本，所有菌株均經過標準生化試驗和血清學檢測。所有被測菌株均對亞胺培南、美羅培南及三代頭孢菌素敏感。耐藥率最高的復方新諾明(87%，14/16)，其次是氨芐西林(81%，13/16)，氯霉素(75%，12/16)。有5株對環丙沙星中介，其中一株同時對左氧氟沙星中介。16株豬霍亂沙門菌對抗菌藥物的耐藥譜見文獻[1]。

1.2 一般臨床資料 16例患兒中男12例、女4例；<1周歲者10例，6例為1~3歲幼兒，分別來自江西不同地區。入院前均有1~10天的高熱史，熱型不規則，熱峰38~40℃，均為急診收治入院，分別有咳嗽、寒戰、腹瀉、黃疸及呼吸困難等體征。所有患兒經臨床抗菌藥物治療后均已痊愈出院。

1.3 耐藥基因的檢測 通過煮沸法提取被測菌株的總DNA，即挑取單個克隆菌落于離心管中，再加入150μl的雙蒸水煮沸10min，然后4℃以10600×g離心15 min，取上清液-20℃儲存作為PCR模板備用。采用PCR法及DNA測序法對16株豬霍亂沙門菌進行β-內酰胺酶類耐藥基因檢測，包括blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，引物序列參照文獻[2]。

1.4 PFGE分析 挑取血平皿中培養過夜的單克隆菌株用低熔點膠灌模，蛋白酶K 50℃消化2 h，40 U的Xba I酶切2h，1.0%的脈沖場凝膠電泳儀專用膠，電泳儀為美國Bio-Rad公司生產的CHEFMapperXA，0．5×TBE 緩沖液，溫度 14℃，電壓為 6V／cm，角度 120°，脈沖時間 5~20s，電泳時間為19h，分子量標記物為LadderDNA。電泳后EB染色，紫外燈觀察結果。PFGE結果分型按美國疾病控制和預防中心Tenover等[3]推薦的方法判讀，結果少于3個條帶不同的被認為同一型。

2 結果

2.1 耐藥基因 對氨芐西林耐藥的13株(81%，13/16)豬霍亂沙門菌經PCR檢測為blaTEM陽性，經測序確定全部為blaTEM-1型，所有菌株的blaCTX-M和blaSHV基因均為陰性。耐藥基因檢出率見表1。

表1 16株豬霍亂沙門菌耐藥基因檢測結果[株(%)]

2.2 PFGE結果 所有菌株都可得到清晰的PFGE圖譜，PFGE分型圖譜見圖1，經過聚類分析，16株豬霍亂沙門菌可分為5個PFGE型，分別命名為A~E型。其中A型包含12株菌，B、C、D、E型均為1株菌。13株blaTEM-1基因陽性的豬霍亂沙門菌株分別為 A 型(11株)，B 型(1株)，D 型(1株)；詳細結果見表2。

圖1 16株豬霍亂沙門菌PFGE分型結果

3 討論

沙門菌是全球范圍內最常見的食源性腸道致病菌，已知的沙門菌血清型有2600余種，其中豬霍亂沙門菌是臨床最常見的血清型之一。本次研究表明，細菌對氨芐西林等β-內酰胺酶類抗菌藥物嚴重耐藥(81%，13/16)，既往對細菌耐藥機制研究發現，產β-內酰胺酶是革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥最重要的原因，TEM是革蘭陰性菌中最常見的β-內酰胺酶[4]，是由細菌質粒介導的能被β-內酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)所抑制的一類酶，可水解青霉素類抗菌藥物。本研究資料顯示，13株對氨芐西林耐藥菌株對TEM基因檢測結果陽性，特異性TEM引物進一步擴增及測序結果顯示，全部為TEM-1型廣譜β-內酰胺酶。說明細菌對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥性主要由TEM基因編碼，產TEM-1型β-內酰胺酶是本地區豬霍亂沙門菌對氨芐西林耐藥的主要機制。

注：－表示菌株未檢測出耐藥基因或未對抗菌藥物產生耐藥，(I)為中介；AMP為氨芐西林，SXT為復方新諾明，C為氯霉素，CIP為環丙沙星，LEV為左旋氧氟沙星。

PFGE分型方法是直接針對整個細菌染色體DNA進行分析，采用稀有位點限制性內切酶將染色體切成5~30條大小約為10~800kb的片段，再通過2個或多個交變電場，使得DNA分子的電泳方向隨電場的變化而變化，在凝膠中呈蛇形向前移動，從而使大分子DNA得到分離，PFGE分辨力高，重復性好，是目前最理想的分型方法，常作為評價其它分型方法的參考標準[5,6]。本研究采用此方法對豬霍亂沙門菌進行分型，所有菌株都可得到10~20條左右條帶，16株豬霍亂沙門菌共分為5個PFGE型，分型結果較好。對比PFGE分型結果和耐藥基因測定結果可以看出，A 型是最主要的類型(75%，12/16)，13株blaTEM-1基因陽性菌株A型中有11株，說明本地區豬霍亂沙門菌腸道外感染主要是由克隆性傳播所引起的。分析耐藥譜測定結果可以看出，同種PFGE型有著相同或非常相似的耐藥譜，PFGE型相同而耐藥譜不同的情況則可能是由于耐藥基因發生突變，但是突變位點并不在PFGE酶切位點上，導致耐藥情況不能從PFGE分型上體現出來[7]。從臨床資料分析上看，同一PFGE型中的細菌或來自江西不同地區，或來自不同時間，考慮為院外散發感染，雖為同一克隆傳播，但可以排除院內交叉感染可能。

[1]黃凱,段榮,余曉君.16例嬰幼兒敗血癥豬霍亂沙門菌感染的耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(5):466-467.

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