鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量與臨床分期的關系研究

楊雀飛，何彪，譚貴海

(高州市人民醫院檢驗科,廣東 高州525200)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發于鼻咽部頭頸的惡性腫瘤，在我國南方最為常見，其發病率約為30～50/10萬[1]。有大量研究發現，絕大多數鼻咽癌患者癌細胞中均存在EB(Epstein-Barr virus，EBV)病毒，在鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中可以檢測到游離的EB病毒DNA，說明鼻咽癌的發病與EB病毒感染和發展有密切關聯[2，3]。近年應用分子雜交及聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測亦證實EB病毒在鼻咽癌發展中的重要作用[4，5]。EB病毒DNA載量與鼻咽癌發生發展有什么樣的聯系一直以來是人們所關注和研究的課題之一，本文定量檢測鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量，為鼻咽癌患者臨床分期提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2013年1月我院腫瘤科收治住院的87例鼻咽癌患者，全部患者均經病理活檢確診為鼻咽癌。其中男性49例，女性38例；年齡26~82歲，平均年齡54歲。依據92福州分期標準 (1992年在福州召開的全國腫瘤與放射學術會議)進行分期，其中Ⅰ期23例(26.4%)、Ⅱ期 18 例(20.7%)、Ⅲ期 26 例(29.9%)和Ⅳ期20例(23.0%)。

1.2 儀器與試劑 5個由低濃度到高濃度的EB病毒DNA陽性細胞株作為標準品均購買于中南大學腫瘤研究所，實時熒光定量PCR儀為ABI公司產品，PCR相關試劑及淋巴細胞分離液購自中山大學達安基因股份有限公司。

1.3 標本處理 首先，采集87例患者外周血標本2mL存于EDTA-Na2抗凝管中，然后，在無菌的塑料離心管中加入2ml淋巴細胞分離液，將血液進行1:1稀釋后緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細胞分離液的離心管中，1500r/min，15min，進行離心。用長嘴膠頭滴管吸取分離液層中的淋巴細胞(第二層)，把吸取的淋巴細胞溶液裝入另一無菌離心管中加入5ml PBS洗滌，1500r/min,經離心10min后，去掉上層液體，保留離心管底的若干白色物質，即淋巴細胞；再加入等體積Tris-EDTA裂解液和蛋白酶K，37℃水浴1 h，高速離心后取上清，經酚-氯仿抽提，乙醇沉淀清洗得到DNA模板[6]，以 EB病毒DNA為模板進行擴增檢測。

1.4 實驗方法 采用實時熒光定量PCR技術對淋巴細胞中EB病毒游離DNA進行定量測定。反應條件為 93℃ 3min，93℃ 45s， 55℃ 2min， 共 40 個循環。反應結束后，用計算機將樣本和標準曲線對比，計算出反應體系中待測標本中DNA的拷貝數。PCR反應總體積為50μl，含l0μl PCR緩沖液，引物和對應的熒光標記探針各 10pmol。dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP 各 200 μmol／L，Tap 聚合酶5U，DNA 模板 5μl， 吸取抽提的 DNA 5μl入 PCR的反應管中，在ABI7300自動熒光PCR儀上進行擴增。陽性標準定義為：DNA水平>1×103拷貝/m l判斷為陽性；陰性標準定義為：DNA≤1×103拷貝/ml判斷為陰性。

1.5 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗。計量資料采用 x±s表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA檢測 以EB病毒DNA標準品進行定量，計算不同患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA的拷貝數及中位數。結果顯示，鼻咽癌患者淋巴細胞中EB病毒DNA的陽性率為82.76%(72/87)，中位數為7.58×106拷貝數/ml，經 χ2檢驗分析，不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較有統計學差異(P<0.05)，結果見表1。

2.2 不同分期鼻咽癌患者EB病毒的含量有明顯差異 87例鼻咽癌患者檢測EB病毒DNA載量中，Ⅰ期23例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期20例的鼻咽癌患者DNA拷貝數平均數分別為 (4.25±1.14)×103，(4.56±0.68)×104，(7.88±1.65)×105，(8.09±1.65)×106。 對不同組間進行 t檢驗，P<0.05或 P<0.01結果有統計學差異，結果見表2。

表1 不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較

表2 鼻咽癌患者DNA拷貝數

3 討論

鼻咽癌是一種與EB病毒非常密切的惡性腫瘤，有學者認為在鼻咽癌的發生發展中，EB病毒感染淋巴細胞是感染及致病的重要機制[7]。而在目前臨床應用廣泛的EB病毒血清標志物檢測指標中，EB病毒DNA定量測定應用對鼻咽癌的診斷及預后的預測有著很大的優勢[8，9]。本文資料顯示，采用實時熒光定量PCR法對我院87例鼻咽癌患者外周血淋巴細胞EB病毒DNA含量檢測，結果發現鼻咽癌患者的陽性率為82.76%(72/87)，說明外周血淋巴細胞中EB病毒檢測在鼻咽癌輔助診斷中具有極高價值。然而，有研究分析[10]EB病毒感染鼻咽組織是普遍現象，且感染發生在癌變前，由于EBV存在F和f兩種亞型，故檢出陽性率不可能達到100%。

鼻咽癌臨床分期指導下的個體化綜合治療已成為腫瘤治療的規范。鼻咽癌治療療效在一定程度上決定于鼻咽癌所處臨床分期，Ⅰ-Ⅳ期5年生存率分別為92.38%、79.64%、62.31%和40.16%，鼻咽癌的臨床分期在鼻咽癌治療中起重要作用[11]。研究發現鼻咽癌患者淋巴細胞中存在大量游離的EB病毒DNA，并發現EB病毒DNA隨著腫瘤消長而變化，鼻咽癌患者EB病毒DNA檢測在鼻咽癌治療評價中的重要性已得到普遍認可，然而外周血淋巴細胞中EB病毒DNA在初診鼻咽癌臨床分期中的作用仍不十分清楚。

為進一步明確鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA鼻咽癌患者臨床分期的關系，本實驗對比分析了鼻咽癌患者EB病毒DNA與所處臨床分期的關系，以明確EB病毒DNA在鼻咽癌臨床分期中的價值。本實驗采用實時熒光定量PCR法檢測EB病毒DNA載量，分析外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量與鼻咽癌患者臨床分期關系。結果顯示EB病毒DNA載量與鼻咽癌臨床分期密切相關，即隨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的遞增，EB病毒DNA拷貝數越高，這與相關報道相同[12]。Ⅲ、Ⅳ期EB病毒DNA拷貝數明顯高于Ⅰ、Ⅱ期的，即臨床分期越晚，患者淋巴細胞中EB病毒DNA載量越高,外周血淋巴細胞中EB病毒游離DNA拷貝數與鼻咽癌分期相一致，很好地反映了鼻咽癌臨床特征，EB游離DNA拷貝數與患者體內腫瘤負荷呈正相關，提示EB病毒DNA載量與鼻咽癌病情進展密切相關，可作為病情監測及判斷療效的一種有效手段。

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