脂多糖對幼年哮喘大鼠Toll樣受體4及氣道炎癥的作用

馬力 王亞亭

支氣管哮喘簡稱哮喘，是嚴重威脅公共健康的慢性肺部炎癥性疾病。因環境因素對其發病起著重要的作用，故Strachan提出了衛生假說。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)的發現為衛生假說提供了理論依據。TLR4主要識別革蘭陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分，參與調節Th0細胞向 Th1或 Th2細胞增殖分化［1］。其中Th1應答對哮喘有保護作用，Th2能促進哮喘氣道變態反應性炎癥的形成。本課題針對不同濃度脂多糖對哮喘大鼠肺組織Toll樣受體4表達及氣道炎癥的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性健康SD大鼠50只，體重130～150 g;4～6周齡，由安徽醫科大學動物中心提供。隨機將其分為對照組(A)、哮喘組(B)、地塞米松組(C)低劑量LPS組(D1)及高劑量LPS組(D2)共5組，每組10只。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠哮喘模型建立、樣品的留取與保存

1.2.1.1 動物模型的復制:B組大鼠第1、第8天予以OVA/Al(OH)3混合液1 ml［含 Al(OH)3100 mg和OVA 1 mg］腹腔注射致敏，第15天予以1%OVA霧化激發30 min，持續3 d。A組以0.9%氯化鈉溶液代替OVA進行致敏與激發。C組:待腹腔注射1 ml含100 μg地塞米松1 h后在致敏和激發。D1組、D2組在致敏階段每隔2 d 予以 1 ml含 0.1 μg、100 μg E.coil LPS腹腔注射，激發階段待每次予以相同劑量濃度E.coil LPS腹腔注射1 h后在進行激發。

1.2.1.2 樣品的留取與保存:末次激發后1 d，腹腔注射麻醉采用10%水合氯醛溶液400 mg/kg，打開腹腔，腹主動脈取血，離心 10 min，3 000 r/min，吸取血清，－80℃儲存備用。胸腔打開，肺組織分離，左主支氣管結扎，右肺經氣管行灌洗，分4次注入10 ml0.9%氯化鈉溶液，輕輕按摩肺組織，30 s后回收灌洗液，回收率超過80%，然后離心10 min，3 000 r/min，取上清－80℃儲存備用。細胞沉淀用于細胞總數與分類計數。左肺近肺門組織切取，4%多聚甲醛固定，原位雜交標本固定2～3 h，HE染色和細胞凋亡檢測標本固定5～6 h后，轉入70%乙醇，常規石蠟包埋切片［2］。

1.2.2 試驗方法:通過光鏡觀察肺組織病理變化及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中嗜酸性粒細胞(Eosinophils，EOS)計數，酶聯免疫吸附試驗、原位雜交法及末端脫氧核苷酰基轉移酶介導性dUTP切口末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end，TUNEL)對各組大鼠肺組織TLR4mRNA表達，血清OVA-sIgE含量及EOS凋亡進行檢測。

1.3 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對哮喘大鼠肺組織的病理變化 高倍鏡下觀察HE染色肺組織切片，A組肺間質視野清晰，肺組織形態良好，可見肺泡管、小支氣管，未見明顯炎癥細胞浸潤。B組肺間質及肺泡腔內、支氣管及血管周圍大量炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜下水腫，黏膜皺褶增多，粘液腺增生。與B組比較，C組和D2組上述現象明顯減輕，D1組無明顯變化。見圖1～5。

圖1 A組大鼠肺組織無炎癥細胞浸潤(光鏡×200)

圖2 B組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤(光鏡×200)

圖3 C組大鼠肺組織少量炎癥細胞浸潤(光鏡×200)

圖4 D1組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤(光鏡×200)

圖5 D2組大鼠肺組織少量炎癥細胞浸潤(光鏡×200)

2.2 對哮喘大鼠炎性細胞的改變 BALF中細胞總數、EOS計數及EOS百分比:B組均明顯高于A組(P＜0.01);C組和D2組均明顯低于B組(P＜0.01);D1組與B組均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 5組大鼠BALF中細胞總數、EOS計數及EOS百分比比較±s

表1 5組大鼠BALF中細胞總數、EOS計數及EOS百分比比較±s

注:與 B 組比較，*P ＜0.01

組別 細胞總數(×109/L) EOS計數(×107/L) EOS百分比(%)A 組 2.00 ±0.11* 1.13 ±0.16* 0.56 ±0.05*B 組 4.28 ±0.08 34.43 ±1.42 8.03 ±0.19 C 組 2.41 ±0.04* 4.84 ±0.49* 2.01 ±0.18*D1 組 4.33 ±0.07 34.59 ±0.76 7.99 ±0.08 D2 組 2.31 ±0.05* 4.33 ±0.67* 1.87 ±0.25*

2.3 對哮喘大鼠OVA-sIgE含量的影響 OVA-sIgE含量:C組、D2組與A相比有明顯差異(P＜0.01)，但較B組有明顯降低(P＜0.01)。D1組與B組比較無統計學差異(P＞0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清OVA-sIgE含量比較μg/ml，±s

表2 5組大鼠血清OVA-sIgE含量比較μg/ml，±s

注:與 B 組比較，*P ＜0.01;與 A 組比較，#P ＜0.01

組別OVA-sIgE A 組 14.72 ±1.69*B 組 82.33 ±2.93 C 組 44.62 ±2.72*#D1 組 84.38 ±2.31 D2 組 42.12 ±2.90*#

2.4 對哮喘大鼠肺組織TLR4mRNA表達及EOS凋亡的影響 TLR4mRNA表達能力:A組與B組差異無統計學意義(P＞0.05);C組、D1組、D2組均明顯高于B組(P＜0.01);D1組明顯低于 D2組(P＜0.01)。EOS凋亡率:B組和D1組有少許核深染為棕褐色的凋亡細胞。A組、C組、D2組較B組增多(P＜0.05 或 ＜0.01)。見表3、4。

表3 5組大鼠TLR4mRNA表達比較±s

表3 5組大鼠TLR4mRNA表達比較±s

注:與 B 比較，*P ＜0.01;與D1 組比較，#P ＜0.01;與 C 組比較，△P ＜0.01

組別 TLR4mRNA(A值)A組24.60 ±0.48 B 組 25.74 ±1.75 C 組 34.38 ±1.48*D1 組 29.44 ±2.27*D2 組 39.18 ±1.30*#△

表4 5組大鼠肺組織EOS凋亡率比較%，±s

表4 5組大鼠肺組織EOS凋亡率比較%，±s

注:與 B 組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.05;與 C 組比較，△P ＜0.01

組別 EOS 凋亡率A 組 8.86 ±0.72*B 組 7.13 ±0.98 C 組 13.34 ±0.61#D1 組 7.14 ±0.64 D2 組 14.66 ±0.85#△

3 討論

哮喘是威脅公共健康常見的一種慢性肺部疾病，多種炎性細胞浸潤是其的一種重要特征［3］。鄭燕妮等［4］表明脂多糖來源的髓源抑制性細胞可能通過抑制Th2過度免疫應答和上調小鼠外周血Treg細胞比例，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥。LPS濃度對Th1/Th2炎癥反應具有一定的影響。低劑量LPS可增強Th2敏感性，高劑量LPS可增強Th1反應，表在過敏性炎癥反應中LPS具有獨特的雙向作用［5］。本文通過高倍鏡來觀察HE染色肺組織切片，結果A組肺間質視野清晰，肺組織形態良好，可見肺泡管、小支氣管，未見明顯炎癥細胞浸潤。B組肺間質及肺泡腔內、支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤，支氣管黏膜下水腫，粘膜皺褶增多，粘液腺增生。與B組比較，C組和D2組上述現象明顯減輕，D1組無明顯變化。本文又通過對BALF中炎癥細胞總數及分類計數，結果B組均明顯高于A組(P＜0.01);C組和D2組均明顯低于B組(P＜0.01);D1組與B組均差異無統計學意義(P＞0.05)。研究說明地塞米松和高劑量LPS能緩解哮喘大鼠氣道炎性細胞浸潤，而低劑量LPS無此功能。該結果與肺組織病理改變相符。

人群調查表明IgE水平升高與哮喘的增加相關，IgE水平的升高會導致氣道黏膜水腫、氣道平滑肌痙攣、粘液分泌亢進，從而誘發氣道高反應性［6］。Rodriguez等［7］表明，LPS 通過活化 TLR4，可激活天然免疫，抑制致敏小鼠IgE介導的變態反應、EOS募集、肺內炎癥、粘液分泌增多及氣道高反應性。本文通過ELISA法檢測大鼠血清OVA-sIgE水平，結果C組、D2組與A相比有明顯差異(P＜0.01)，但較B組有明顯降低(P＜0.01)。D1組與B組比較無統計學差異(P＞0.05)。本研究表明哮喘組大鼠特異性IgE抗體水平較明顯升高，這與哮喘的特征相一致。高劑量LPS可降低血清OVA-sIgE水平，而低劑量LPS對血清OVA-sIgE水平無影響，進一步證實LPS對哮喘的影響具有劑量相關性。

動物實驗表明，小劑量LPS小鼠模型可使支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞增多，Th2免疫反應增強，而對照小鼠及TLR4基因缺陷小鼠，卻無Th2免疫反應增強［8］。結果說明，Th2應答需TLR4信號，在機體向Th2免疫反應發展中TLR4有著重要的作用。李鴻佳等［9］研究表明低劑量 LPS(0.1 mg/L)誘導哮喘小鼠AM的TLR4高表達，使肺部炎癥加重，而高劑量LPS(100 mg/L)可能會減輕變態反應癥狀。本研究中，TLR4mRNA的細胞胞漿著色呈棕黃色，主要表達于平滑肌細胞，肺巨噬細胞，支氣管上皮細胞及EOS等。C組、D1組、D2組均明顯高于B組(P＜0.01);D1組明顯低于D2組(P＜0.01)。本研究表明，在免疫系統中TLR4對LPS反應有著重要的作用，LPS能誘導哮喘大鼠肺組織TLR4mRNA表達的上調。低劑量LPS與高劑量LPS均能提高TLR4mRNA表達能力，且隨LPS濃度的增高TLR4mRNA表達逐漸增加，而單純OVA不能刺激TLR4 mRNA表達增強。

嗜酸性粒細胞(Eosinophils，EOS)是哮喘發病機制中主要效應細胞，誘導哮喘患者EOS的凋亡可緩解哮喘病情的嚴重程度，且不會因細胞死亡而發生局部炎癥反應［10］。本研究中，B組和D1組有少許核深染為棕褐色的凋亡細胞。A組、C組、D2組較B組增多(P＜0.05或＜0.01)。研究說明LPS影響哮喘發展的機制與誘導EOS凋亡有關。

綜上所述，高劑量脂多糖能降低血清中OVA-sIgE水平，上調TLR4表達，誘導哮喘大鼠肺組織EOS凋亡;低劑量脂多糖雖激活TLR4信號通路，卻不能緩解哮喘的氣道炎癥。可見，對哮喘大鼠使用高劑量LPS進行干預，在哮喘的防治中，可達到地塞米松的治療效果。

1 谷元廷，吳河水，徐建波，等.全肝缺血再灌注小鼠肺泡巨噬細胞Toll樣受體2/4的表達.鄭州大學學報:醫學版，2006，41:1047-1049.

2 Celedon JC，Milton DK，Ramsey CD，et al.Exposure to dust mite allergen and endotoxin in early life and asthma and atopy in childhood.Allergy Clin Immunol，2007，120:144-149.

3 Shi L，Wang JS，Liu XM，et al.Upregulated functional expression of Toll like receptor 4 in mesenchymal stem cells induced by lipopolysaccharide.Chin Med J(Enql)，2007，120:1685-1688.

4 鄭燕妮，于化鵬，陳新，等.脂多糖誘導髓源抑制性細胞對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其機制.中華醫學雜志，2012，92:3147-3150.

5 Hemelaers L，Louis R.Eotaxin:a important chemokine in asthma.Re Med Liege，2006，61:223-226.

6 楊玲，許以平，曹玲仙，等.不同濃度肽聚糖、脂多糖、聚肌胞苷酸對過敏性支氣管哮喘患者嗜堿性粒細胞釋放能力的作用.上海醫學，2008，31:853-855.

7 Rodriguez D，Keller AC，Faquim-Mauro EL，et al.Bacterial lipopolysaccharide signaling through Toll-like receptor 4 suppresses asthma-like responses via nitric oxide synthase 2 activity.J Immunol，2003，171:1001-1008.

8 Eswarappa SM，Basu N，Joy O，et al.Folimycin(concanamycin A)inhibits LPS-induced nitric oxide production and reduces surface localization of TLR4 in murine macrophages.Innate Immun，2008，14:13-24.

9 李鴻佳，王淑娟，李艷麗，等.不同劑量脂多糖預處理對哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究.細胞與分子免疫學雜志，2008，24:1008-1010.

10 Hemelaers L，Louis R.Eotaxin:a important chemokine in asthma.Re Med Liege，2006，61:223-226.