RECK、MMP-14及MMP-2在喉癌中的表達與相關性研究

左文娜 王洪琴 吳干勛 李國麗 李丹

腫瘤轉移抑制基因在惡性腫瘤的發生、發展和侵襲、轉移過程中發揮著重要作用。基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于重要的蛋白酶類之一，其可以降解多種細胞外基質成份和血管基膜，破壞腫瘤細胞的侵襲，促進血管形成。RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazalmotifs)基因是近年來新發現的一種新型腫瘤轉移抑制基因和基質金屬蛋白酶抑制劑，可抑制多種MMP表達，阻礙腫瘤細胞的發生、發展及侵襲。本研究對41例喉癌患者的石蠟標本采用流式細胞術檢測并分析RECK基因和MMP-14、MMP-2在腫瘤組織中表達的相關性及與病理參數之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2009年12月至2011年1月收集的72例腫瘤組織，按類型不同分為喉癌組織41例、癌旁組織16例 (距腫瘤切緣＞0.5 cm)及喉部正常黏膜組織15例，分別為喉癌組、癌旁組及對照組。根據國際抗癌協會(UICC)TNM分類臨床分期標準，Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期24例。喉癌組中男30例，女11例;根據術后病理，伴隨淋巴結轉移11例，未伴隨30例;年齡40～76歲，中位年齡60歲;喉癌分型:聲門上型21例，聲門型15例，聲門下型5例;病理學分級:G1組16例，G2組18例，G3組7例;吸煙量＞400(年×支/d)者20例，≤400(年 ×支/d)者21例;所有腫瘤組織均經組織病理學確診為鱗狀細胞癌、炎癥或正常組織。且術前均未行放療、化療等治療措施。

1.2 方法

1.2.1 制備單細胞懸液:將0.5 g組織放置于120目不銹鋼網上剪碎，用鑷子及0.9%氯化鈉溶液輕輕搓洗至自然沉淀，收集細胞懸液。再次將混懸液過濾，去除細胞團塊。1 000 r/min離心2 min，再次重復棄上清液。加入1 ml磷酸鹽緩沖液懸浮細胞，制成單細胞懸液。

1.2.2 細胞的免疫熒光標記:取0.1 ml以上液體，按1∶100 濃度分別加入0.1 ml RECK、MMP-14 及 MMP-2抗體工作液，加入磷酸鹽緩沖液10ml，同法離心5 min，棄上清液。之后加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液0.1 ml，常溫孵育30 min，避光，熒光染色。上述方法重復一次后剔除未結合的熒光二抗。

1.2.3 REC基因及MMP-14蛋白檢測:采用EPics-XLⅡ型流式細胞儀(美國Beckerman Coulter公司)、氬離子激光器、ExPo32ADC、Muticycle AN分析軟件等對數據進行免疫熒光分析和擬合分析，調整儀器CV值＜2%。按照熒光指數(FI)對RECK、MMP-14蛋白及MMP-2蛋白的定量表達進行分析。公式為FI=實驗樣品均道值/正常組織均道值。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，同時采用單因素方差分析、SNK檢驗及直線相關及直線回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組RECK、MMP-14和MMP-2蛋白的表達 喉癌組織中RECK蛋白的表達量低于癌旁組及對照組(P均＜0.05)。癌旁組和對照組中RECK蛋白的表達量差異無統計學意義(P=0.063)。喉癌組織中MMP-14和MMP-2蛋白的表達量均高于癌旁組及對照組(P均 ＜0.05)。癌旁組和對照組中 MMP-14和MMP-2蛋白的表達量差異無統計學意義(P=0.763和P=0.895)。喉癌組織中RECK和MMP-14、MMP-2蛋白的表達與臨床病理因素有關。見表1、2。

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表達量比較±s

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表達量比較±s

注:與喉癌組比較，*P ＜0.05

組別 RECK蛋白 MMP-14蛋白 MMP-2蛋白喉癌組(n=41)0.8173 ±0.1043 1.7135 ±0.1729 3.5987 ±0.1878癌旁組(n=16) 1.0926 ±0.1632* 1.3298 ±0.1427* 1.0322 ±0.1611*對照組(n=15) 1.1278 ±0.1322* 0.96787 ±0.7983* 0.6789 ±0.1657*

表2 喉癌組織中RECK在淋巴結轉移、臨床分期和病理分級中的表達量±s

表2 喉癌組織中RECK在淋巴結轉移、臨床分期和病理分級中的表達量±s

項目 RECK蛋白 P值 MMP-14蛋白 P值 MMP-2蛋白 P值淋巴結轉移有(n=11) 0.5382 ±0.0934 1.8991 ±0.2152 4.1026 ±0.2008無(n=30) 1.1021 ±0.1415 0.036 1.4623 ±0.1856 0.012 2.7869 ±0.2035 0.041臨床分期Ⅰ ～ Ⅱ期(n=17) 0.9169 ±0.1324 1.4112 ±0.1703 2.7589 ±0.1736Ⅲ ～ Ⅳ期(n=24) 0.6089 ±0.0714 0.024 1.7300 ±0.1579 0.030 3.9978 ±0.1876 0.003病理分級G1(n=16) 1.1022 ±0.1369 1.4213 ±0.2654 1.9326 ±0.1486 G2(n=18) 0.7533 ±0.0265 1.6849 ±0.2208 3.0120 ±0.2425 G3(n=7) 0.3148 ±0.0902 0.018 1.9538 ±0.2162 0.017 4.2386 ±0.1953 0.001

2.2 喉癌組織中RECK與MMP-14及MMP-2蛋白表達的相關性 RECK與MMP-14及MMP-2蛋白之間有顯著的負相關線性關系，(r= －0.629，P＜0.05)及(r= －0.804，P＜0.05);喉癌組織中 MMP-14、MMP-2蛋白之間有顯著的直線性相關關系，為正相關(r=0.612，P＜0.05)。見圖1 ～3。

圖1 RECK與 MMP-14呈負相關(直線回歸方程是Y=2.002－0.601X)

圖2 RECK與 MMP-2呈負相關(直線回歸方程是Y=2.578－0.601X)

圖3 MMP-14與 MMP-2呈正相關(直線回歸方程是Y=1.302+0.671X)

3 討論

MMP-2又稱Ⅳ型膠原酶、明膠酶，是MMPs的家族成員之一，是腫瘤的侵襲和轉移的過程中發揮重要作用的酶［1］。可以降解基底膜中的Ⅳ型膠原、明膠等，使基底膜斷裂，破壞血管，使其完整性受到損害［2，3］。MMP-14/MTl-MMP 是 MT-MMP 家族中首位被發現的成員，其可啟動細胞表面多個蛋白級聯反應［4］。MMP-14和MMP-2有著密切關系，前者可以激活細胞膜上的 MMP-2，促進腫瘤生長［4］。

田振囡等［5］研究報道MMP-2和MMP-14在乳腺癌中高表達且表達與腫瘤大小和腋窩淋巴結轉移呈正相關。江州華等［6］研究報道MMP2及MMPl4在胃癌中高表達，且與胃癌的浸潤深度、淋巴管浸潤、區域淋巴結轉移及TNM分期有關。本研究表明，MMP-14蛋白與MMP-2蛋白在喉癌組織中高度表達，且與淋巴結轉移、臨床分期及病理分級有關，伴隨淋巴結轉移、臨床分期晚、病理分級低時，MMP-14蛋白及MMP-2蛋白顯高表達。提示MMP-14、MMP-2可促進腫瘤的生長，侵襲和轉移。MMP-14可以作為臨床上判斷喉癌預后的指標。

RECK基因是日本學者Takahashi于1998年發現的，它可抑制MMPs的表達與活動，有關研究顯示，有3中基質金屬蛋白酶(MMPs)能被RECK調節:MMP-2、MMP-9和MMP-14，而在腫瘤侵潤轉移過程中涉及到的主要蛋白水解酶有MMP-2和MMP-9。膜錨定的RECK通過與 RECK結合并相互作用，使 MMP-2、MMP-9及MMP-14的活性受到影響，阻礙血管新生，誘導腫瘤細胞凋亡。

有學者發現，RECK與腫瘤預后密不可分，陽性表達患者的預后要優于陰性表達的患者，由此可以推斷出高表達RECK可使腫瘤細胞的侵襲和轉移受到阻礙［7］。周湘濤等［8］報道，RECK 在胃癌組織中低表達且與分化程度、浸潤深度和有無淋巴結轉移有顯著相關性。張潔等［9］研究報道，RECK在非小細胞肺癌組織中的表達水平較非癌組織顯著降低，RECK蛋白表達與TNM分期有密切關系。張天彪等［10］報道RECK蛋白在口腔鱗癌組織中的表達，明顯低于正常口腔黏膜組織，與有無淋巴結轉移、組織學分級及侵潤程度有關。

由本研究結果可見:(1)相對癌旁組織與正常組織，RECK基因在喉癌組織中為低表達，提示其可能影響喉癌的發生。(2)RECK的表達在有淋巴結轉移、臨床分期越晚、病理分級越低的情況下為低表達，而與喉癌的臨床分型無關，證明RECK參與并抑制了喉癌細胞的侵襲和轉移，發揮了腫瘤轉移抑制基因的作用。(3)RECK基因和MMP-14、MMP-2之間存在顯著的負相關線性關系，說明RECK基因抑制喉癌侵襲和轉移的機制有可能通過下調MMP-14及MMP-2蛋白的表達來實現，更深層次的機制尚待進一步研究。

綜上，MMP-2蛋白和MMP-14蛋白在喉癌中的高表達且與臨床分期、淋巴結轉移、病理分化程度有關，可作為喉癌惡性程度的預測因子。RECK在喉癌組織中的表達低于癌旁組織及正常黏膜組織，RECK基因表達水平高的患者預后明顯好于表達水平低的患者，說明RECK可能通過抑制MMPs從而抑制腫瘤的進展，這就提示我們可以通過運用上調癌細胞中RECK表達的藥物或類似物來阻止腫瘤的侵襲及轉移。

1 Taniwaki K，Fukamachi H，Komori K，et al.Stroma-derived matrix metalloproteinase(MMP)-2 promotes membrane type l-MMP dependent tumor growth in mice.Camcer Res，2007，67:4311-4319.

2 Wang A，Zhang B，Huang H，et al.Suppression of local invasion of ameloblastoma by inhibition of matrix metalloproteinase-2 in vitro.BMC Cancer，2008，8:182-185.

3 Toshimiehi A，Mitsuhiro T，Cheng SQ，et al.Prognnostic values of matrix metalioproteinase family expression in human colorectal carcinoma.Surg Ros，2008，146:32-42.

4 Koyama S.Enhanced Cell surface expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors and tumor-induced host response in progression of human gastric cancer.Dig Dis Sci，2004，49:1621-1630.

5 田振囡，李陽，胡楊，等.MMP-2、MMP-14在乳腺癌中的表達及臨床意義.實用腫瘤學雜志，2010，24:4470450.

6 江州華，吳生華，李小強，等.Wnt5a、MMP2和MMPl4在胃癌中的表達及其對臨床病理特征的影響.中國普外基礎與臨床雜志，2010，17:1077-1082.

7 Noda M，Takahashi C.Recklessness as a hallmark of aggressive cancer.Cancer Sci，2007，98:1659-1665.

8 周湘濤，莊英幟.MMP-9和RECK在胃癌中的表達及意義.臨床醫學，2011，24:46.

9 張潔，李雅莉，楊俠，等.RECK蛋自在非小細胞肺癌中的表達及其與MMP-9 的關系.陜西醫學雜志，2012，41:1296-1298.

10 張天彪，許丹，關一夫，等.RECK和MMP-2在口腔鱗癌中的表達及其與侵襲轉移關系研究.中國實用口腔雜志，2010，3:292-294.