秦皇島市替加環(huán)素對耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌體外抗菌活性研究

張曉玲 霍麗靜 劉鵬 彭宗生

近年來，隨著高產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科菌株占致病菌的比例逐年增高，作為應對該類細菌所致嚴重感染的最后一道防線——碳青霉烯類抗生素的臨床使用也不斷增加，催生出更多的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌，腸桿菌科細菌在我國已迅速上升為院內(nèi)感染的最重要的病原菌之一，給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，替加環(huán)素作為新一代超廣譜抗生素，于2005年6月得到美國食品和藥品管理局(Food and Drug Adiministration，F(xiàn)DA)批準用于治療成人復雜腹腔內(nèi)感染和復雜的皮膚及軟組織感染，是第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物。替加環(huán)素的作用機制主要是通過與核糖體30S亞基結合從而抑制蛋白質的合成［1］。體外藥敏結果顯示對甲氧西林耐藥葡萄球菌、青霉素耐藥肺炎鏈球菌、萬古霉素耐藥腸球菌及多數(shù)革蘭氏陰性桿菌具良好的抗菌活性。隨著替加環(huán)素在臨床使用的增加，需要快速、準確的藥敏結果指導臨床合理使用該類抗菌藥物。為了解其對CRE的體外抗菌活性，本研究回顧性收集秦皇島地區(qū)三所大型醫(yī)院2012年1月至2013年5月年臨床分離出的110株亞胺培南或美羅培南耐藥的腸桿菌科細菌，采用CLSI推薦的檢測MIC的參考方法瓊脂稀釋法檢測替加環(huán)素的MIC值，數(shù)據(jù)分析采用WHONET 5.6軟件，以了解秦皇島地區(qū)替加環(huán)素對CRE的體外藥物敏感性，為該藥在臨床上的使用提供體外藥物檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源:收集秦皇島市三家大型醫(yī)院臨床分離的CRE共110株，1個患者只收集一次菌株，以保證菌株的不重復性。并記錄患者的科室，病種，年齡，是否接受侵入性操作等基本情況。按照CLSI 2011年M100-S21中折點判定標準厄它培南MIC≥0.5 mg/L，美羅培南 MIC≥2.0 mg/L或亞胺培南 MIC≥2.0 mg/L，判定為耐碳青酶烯類藥物菌株。

1.1.2 抗菌藥物及培養(yǎng)基:抗菌藥物標準品:替加環(huán)素標準粉(美國輝瑞制藥有限公司，批號:L28832-6)儲存于≦20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。美羅培南(住友制藥)，亞胺培南(杭州默沙東制藥有限公司)，厄他培南(杭州默沙東制藥有限公司)。試驗培養(yǎng)基為Mueller-Hinton瓊脂(美國Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 MIC值測定:藥敏試驗嚴格按照2009年《新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程》［2］及CLSI推薦的瓊脂稀釋法測定替加環(huán)素對CRE的MIC值。根據(jù)《替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識》［3］，隔夜存放的M-H瓊脂會使檢測結果升高。所以本研究所使用的M-H瓊脂均為當天新鮮配制。另外由于替加環(huán)素含多酚基團，理化性質活潑，易氧化降解或形成差向異構體，在光線及空氣中久置會導致替加環(huán)素有效抗菌活性降低，影響檢測結果。所以試驗中配制M-H瓊脂稀釋的藥物原液和稀釋的過程要嚴格避光，盡量減少與空氣解觸的時間(黑布遮蓋，加蓋)。稀釋好的不同濃度的含替加環(huán)素的MH培養(yǎng)基加橡膠塞密封置于培養(yǎng)箱中24 h觀察結果。為保證結果的準確性同時用瓊脂稀釋法做質控菌的MIC值，質控菌結果在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)，才可統(tǒng)計結果。

1.2.2 質控范圍和折點判定:目前CLSI沒有替加環(huán)素的藥敏結果判定標準，只給出了替加環(huán)素藥敏試驗中質控菌株可接受的質量控制范圍。本研究中CRE應用大腸埃希菌 ATCC25922的質控范圍0.03～0.25 mg/L。另外，由于CLSI中尚無替加環(huán)素的MIC及折點判定標準，根據(jù)《替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識》，本研究中替加環(huán)素的折點采用FDA的折點判定標準:MIC≤2 mg/L為敏感，MIC≥8 mg/L為耐藥，MIC=4 mg/L為中介。

2 結果

2.1 所收集的110株CRE的體外藥敏結果 110株CRE中，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌66株，占60.0%，對替加環(huán)素敏感率為80.3%。耐碳青霉烯類大腸埃希菌21株，占19.1%，對替加環(huán)素敏感率為95.2%。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌12株，占11.9%，對替加環(huán)素敏感率為91.7%。耐碳青霉烯類產(chǎn)氣腸桿菌11株，占10%，對替加環(huán)素敏感率為81.8%。可見替加環(huán)素對CRE具備較高的體外抗菌活性。對耐碳青霉烯類大腸埃希菌更高達95.2%，對耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的敏感率也可達80%以上。見表1。

表1 耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌對替加環(huán)素體外抗菌活性比較%

2.2 110株CRE對替加環(huán)素的體外敏感率分布 耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌，耐碳青霉烯類大腸埃希菌，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯和耐碳青霉烯類產(chǎn)氣腸桿菌體外敏感率分布MICR50/90依次為1/4、1/2、1/2和1/4 mg/L。見表2。

表2 耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌對替加環(huán)素的體外敏感率分布%

3 討論

產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌在世界范圍內(nèi)的廣泛播散已成為嚴重威脅公共衛(wèi)生問題的重大事件。目前針對其耐藥機制的研究、實驗室檢測以及感染控制研究已取得了重要進展并在不斷深入。在CRE菌株的菌種分布方面，中國大陸以陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌最常見，其次為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌［4］。且碳青霉烯耐藥陰溝腸桿菌的分離率呈逐年上升的趨勢。秦皇島三家收集的110株碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌中，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌占66株。我們對66株陰溝腸桿菌的來源進行了統(tǒng)計分析，其中來源于ICU 39株、外科21、腫瘤科19株、呼吸科15株、CCU 9株神經(jīng)內(nèi)科4株、心內(nèi)科2株。110株陰溝腸桿菌來源于尿路感染的38株，其中21例有導尿史。國內(nèi)相關文獻也有指出，減少侵襲性操作是CRE防控的重要措施。秦皇島地區(qū)CRE的流行趨勢不容樂觀，給臨床選擇用藥帶來了極大的困難。

腸桿菌科細菌碳青霉烯耐藥機制主要有兩大類:一類是膜孔蛋白表達質和(或)量的的缺失導致抗生素攝取下降，同時合并對碳青霉烯類抗生素具有微弱水解活性的β-內(nèi)酰胺酶的過表達。另一類是獲得具有編碼碳青霉烯類抗生素水解活性的碳青霉烯酶基因。其中腸桿菌科細菌中鑒定出的各種碳青霉烯酶分屬于Ambler分類中的A類、B類和D類β內(nèi)酰胺酶。其中A類中的KPC酶是目前最具臨床意義的β內(nèi)酰胺酶。近年來，對腸桿菌科細菌碳青霉烯耐藥機制的研究已成為臨床微生物領域關注的焦點。

替加環(huán)素作為一種半合成的四環(huán)素類藥物，在米諾環(huán)素9位分子上添加叔丁基甘氨肽氨基團而衍生的一種新型四環(huán)素類抗生素。由于9位替代基團形成的空間位阻作用，使其與核糖體靶位的親和性比米諾環(huán)素和四環(huán)素高5倍以上，且細菌對其不易產(chǎn)生耐藥性［5］。替加環(huán)素不能激活四環(huán)素外排蛋白，因此微生物外排泵無法將甘氨酰四環(huán)素類藥物排至胞外。正是由于它克服了獲得性的核糖體保護tet(M)和主動外排tet(A-E)這兩個臨床上產(chǎn)生耐藥性的機制，從而使細菌對替加環(huán)素產(chǎn)生顯著耐藥性的可能性很小，只有及其顯著的突變才有可能導致細菌對替加環(huán)素的耐藥。因而替加環(huán)素目前被認為是一種具有高效而廣譜的抗菌活性的抗生素。

本研究顯示，替加環(huán)素對CRE表現(xiàn)出較好的體外抗菌活性，對CRE的體外敏感率較高，成為僅次于多黏菌素的體外最有效的抗菌藥物。由于該藥在臨床用藥方便及與其它藥物無交叉耐藥，且肝腎毒性低等特點，使其在臨床抗感染治療中具有非常樂觀的前景。同時，做好替加環(huán)素的體外藥敏監(jiān)測，為臨床科學、合理、高效的使用此藥提供支持，是臨床細菌工作者需要做的一項重要工作。

1 杜小幸，王海萍，傅鷹，等.不同藥敏方法檢測替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌敏感性的比較.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:598-599.

2 王輝，倪語星，陳民鈞，等.新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程.中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32:1208-1213.

3 王輝，俞云松，王明貴，等.替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:584-587.

4 劉丁，張莉萍.腸桿菌科細菌碳青霉烯耐藥機制研究與感控策略.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:300-302.

5 張致平.抗耐藥菌藥物研究進展.中國抗生素雜志，2005，30:430.