DNA甲基化在腫瘤發生中的作用

陳莉

·綜述與講座·

DNA甲基化在腫瘤發生中的作用

陳莉

DNA甲基化轉移酶；組蛋白去乙酰化酶；甲基化結合蛋白;腫瘤

在腫瘤形成過程中，表觀遺傳學機制越來越受到重視。即DNA突變時核苷酸序列不變，通過堿基修飾的改變導致基因表達水平的變化。其中，一個重要機制就是DNA甲基化。DNA甲基化就是在DNA復制后，DNA在甲基轉移酶催化下將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基連接到DNA分子的腺嘌呤堿基或胞嘧啶堿基上，進行DNA修復的過程。負責DNA甲基化作用的酶稱為DNA甲基化轉移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)。DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶[1]，它對于維持染色體結構的穩定性，保障基因組表觀遺傳信息在親代細胞間的正確傳遞起著重要作用。除此之外，DNMTs還直接參與基因的轉錄抑制和DNA復制的正確起始等。人類DNA甲基化系統的功能異常將會導致胚胎發育異常，亦可誘發惡性疾病甚至腫瘤的發生。近年來，國內外開展了許多有關DNA甲基化的分子生物學及其作用機制的研究，本文就相關研究現狀予以綜述。

1 DNMTs家族介紹

目前在哺乳動物中發現了3類DNMTs、Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3，其中Dnmt3包括Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，Dnmt3L缺乏有效的催化結構而無催化活性，但能夠增強Dnmt3a、Dnmt3b的甲基化活性[2]。Dnmt2的結構和功能尚不十分明確[3]，目前研究認為它的DNA甲基化酶活性可能非常弱,而且識別位點并非CpG位點,在體外酶活性實驗中,常常難以觀測到DNA甲基化酶活性。Dnmt1和Dnmt3a、Dnmt3b在DNA甲基化修飾過程中起主要作用。人類DNA甲基化的完成主要通過Dnmt1和Dnmt3a、3b的作用。Dnmt1定位與染色體19p13.2，主要功能是在每次DNA復制后，對新合成的DNA鏈進行甲基化修飾，并維持甲基化狀態的穩定，也是非CpG位點從頭甲基化所必需的甲基化轉移酶[4]。DNMT3a定位于人染色體2p33，DNMT3b定位于人染色體20q11.2，兩者的功能主要是催化DNA甲基化新生位點，并在胚胎中建立起新的甲基化模式，即催化非甲基化的DNA成為甲基化的DNA，主要參與DNA的從頭甲基化[5]。

2 HDACs家族介紹

目前在哺乳動物中已發現18個組蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC)，依據與酵母蛋白的同源性這些酶被分為三類。第Ⅰ類通常存在于細胞核內，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8；第Ⅱ類通常能在細胞核與細胞質間穿梭，包括HDAC4、5、6、7、9和10；第Ⅲ類與前兩類的結構完全不同，與酵母Sir2家族蛋白具有同源性，參與調節細胞的衰老和能量代謝，且不能被HDACs抑制劑曲古菌素A(trichostatin A,TSA)抑制。

3 DNMTs與HDACs的相互聯系

有研究發現了5種甲基化結合蛋白(methyl-CpG binding proteins),MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2。MBD1、MBD2、MBD4能夠與mCpG結合，MBD3沒有特異性結合甲基化DNA的能力[6]。其中，MeCP2是唯一能識別單個甲基化CpG位點的結合蛋白，MeCP2能夠通過轉錄抑制區(TRD)與半甲基化,全甲基化DNA形成復合物。Kitamoto等[7]研究認為，啟動子區DNA甲基化與組蛋白的乙酰化修飾具有協同抑制基因轉錄的作用。Nan等[8]研究證明甲基化CpG結合蛋白與組蛋白去乙酰化酶共存于一個細胞復合物中，因而認為DNA甲基化與組蛋白去乙酰化在調控基因轉錄中密切相關。Fuks等[9]通過實驗證明了DNMT1能直接與HDAC結合，并確定了特異性結合位點，這一發現更直接地證明DNA甲基化與組蛋白去乙酰化之間的協調作用。但是組蛋白去乙酰化抑制基因轉錄的作用依賴于甲基化CpG位點的數目。高密度的DNA甲基化使染色質結構高度緊縮并且非常穩定，從而抑制基因轉錄。

4 DNA甲基化的機制

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它不改變DNA的一級結構而調控組織特異性基因的表達。哺乳動物的DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，由DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化完成，將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的的甲基基團轉移至胞嘧啶的第5位碳原子上,使胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶，最終完成DNA甲基化修飾過程。而DNA甲基轉移酶是參與DNA甲基化過程的關鍵酶。基因組DNA中CpG二核苷酸結構高度聚集在一起，稱為CpG島。CpG島為二聯核苷(GC)含量>50%，長度>200 bp的DNA序列，主要位于管家基因和一些組織特異性基因的5’端，覆蓋基因轉錄的啟動子區和第一外顯子，有時延伸到第一內含子，約60%的人類基因組啟動子區含有CpG島[10]。通過DNA甲基敏感限制性內切酶分析,發現人類基因組的甲基化與非甲基化區域間隔排列，非甲基化區主要存在于啟動子區CpG島、基因的5’端和第一個外顯子區[11]。目前的研究發現，DNA甲基化的主要靶點是在基因編碼區，但基因轉錄區甲基化并不關閉基因的表達，而啟動子區CpG島甲基化引起穩定的基因沉默,而轉錄區域的甲基化有助于消除轉錄噪音[12]。

CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化是人類基因組中最主要的表觀遺傳改變。抑癌基因啟動子區域CpG島的甲基化通過一個涉及組蛋白去乙酰化和染色質緊縮的復雜過程而導致轉錄抑制。Dnmts與組蛋白修飾相關因子的相互作用是Dnmt調控基因表達的重要手段。Dnmt1的N末端可以與HDAC1、HDAC2結合,Dnmt3a和Dnmt3b也可以招募HDAC,從而使組蛋白去乙酰化[13]。Worthley等[14]研究表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA、DNA穩定及DNA與蛋白質作用方式的改變，抑制基因轉錄從影響基因表達。

一般認為啟動子區DNA甲基化通過兩種途徑抑制基因表達：第一種是甲基化CpG島的甲基基團可以阻止特異性轉錄因子與啟動子CpG位點的結合,直接抑制基因轉錄[15];另一種是通過DNA甲基結合蛋白(methyl-CpG-binding proteins,MBD)招募一些阻礙復合物,可以和啟動子區甲基化DNA特異性結合，競爭性抑制了轉錄因子與特定的DNA序列的結合,間接抑制基因轉錄[16]。組織特異性基因啟動子區CpG島在特定的組織中保持非甲基化或低甲基化狀態，而使該類基因表達增加，進而參與細胞的生長發育，使細胞向特定的組織方向分化；而在其他組織中的該類基因則呈高甲基化狀態，表達受抑制。即轉錄活性基因呈去甲基化或低甲基化狀態，而非活性基因呈高甲基化狀態。許多非活性基因不能表達主要是由于啟動子區域的CpG島高度甲基化而不能啟動轉錄，導致基因沉默[17]。通常情況下，啟動子區的CpG島處于非甲基化狀態，基因能正常表達；當其發生甲基化時，便影響基因的轉錄調控，使基因表達沉默。因此，DNA甲基化與基因轉錄活性密切相關，一些抑癌基因由于啟動子的甲基化使該基因表達沉默或下調，因此在調控組織細胞的生長分化和腫瘤的發生發展中起著重要作用[18]。另一方面，癌基因在腫瘤細胞中表達上調，與啟動子區低甲基化密切相關。越來越多的研究表明[19]，無論異常的DNA高甲基化還是低甲基化均可導致基因表達異常，從而促進腫瘤的發生。

5 腫瘤中DNMTs過度表達

大多數腫瘤細胞的DNMTs表達水平明顯高于正常細胞，并與抑癌基因啟動子高甲基化狀態相關，Jin等[20]研究發現，DNMT3b在大多數腫瘤細胞中過表達。曾宇等[21]采用RT-PCR技術檢測DNMT1，3a、3bmRNA在40例膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達結果顯示：膀胱癌組織中DNMT1、3b表達的陽性率均高于正常對照組，DNMT3a的表達率與正常對照組無明顯差異，三種基因的表達在不同腫瘤分級、分期、生長方式及原發腫瘤與復發腫瘤之間差異無統計學意義。DNMT1與DNMT3b表達值明顯相關，提示DNMT1、3b是膀胱癌形成、發展中的早期事件，可作為早期診斷和復發監測的有效指標，DNMT1和DNMT3b的表達可能存在共同調節機制。彭建新等[22]研究發現，肝癌組織中DNMT1，3a、3bmRNA顯著高于其在癌旁組織，肝硬化組織和慢性肝炎組織中的表達，DNMT1蛋白表達與腫瘤大小，數目，有無血管侵犯，TNM分期有關。

6 DNA甲基化與腫瘤的治療

Wnt通路在腫瘤發生發展過程中起著重要作用。SFRPs家族作為Wnt通路的重要拮抗劑，在結直腸癌細胞株及原發性結腸腫瘤樣本中均發現4個SFRP家族成員(SFRP1、2、4、5)存在高頻甲基化[23]，在胃癌，食管癌，肝癌，胰腺癌等其他消化道腫瘤中SFRPs基因也存在著不同程度的甲基化，且經甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷處理后可恢復SFRPs的表達。Uhm等[24]檢測到在膽管癌細胞株中ID4、DLC-1、和SFRP1三種抑癌基因存在高度甲基化,而在非腫瘤組織及正常肝細胞株中檢出率低,用5-氮雜胞苷處理后這些基因表達上調,這些結果不僅顯示DNA甲基化異常可能促進膽管癌的發生,而且也說明DNA甲基化抑制劑可以用于腫瘤的治療。Fan等[25]研究結果顯示聯合應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑和DNMTs抑制劑可以恢復ER alpha陰性乳腺癌細胞株對內分泌治療的敏感性。這些實驗研究證實了DNA甲基化抑制劑可以誘導腫瘤抑制基因的表達,它們將作為抗癌制劑在腫瘤治療中發揮重要作用。

由于高度甲基化而導致的抑癌基因轉錄失活并不改變基因本身的序列，因此從理論上說，恢復基因的正常甲基化狀態可以重新激活基因的功能，這為抗腫瘤藥物的設計提供了一個新的思路。DNMTs是DNA甲基化過程的關鍵酶。DNMTs抑制劑是通過抑制DNMTs活性、逆轉基因異常甲基化狀態，而達到抗癌效果的藥物。因此，DNMTs將有可能作為腫瘤治療的新靶點。目前已用于臨床試驗的主要是胞苷結構類似物(5氮雜胞苷、5氮雜脫氧胞苷)，研究表明這類藥物具有恢復沉默基因活性、促進細胞分化等效果，但5氮雜脫氧胞苷具有較強的細胞毒性等不良反應。DNMTs抑制劑類藥物及作用機理有待我們更深入研究。

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056001 河北省邯鄲市中心醫院血液腫瘤科

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