大孔樹脂分離純化松潘烏頭總生物堿研究

王小芳， 張喜民， 鄧月婷， 盧 英， 吳秀琴， 賈繼禧

(甘肅隴神戎發藥業股份有限公司,甘肅 蘭州 730101)

松潘烏頭(AconitunsungpanenseHand-Mazz)[1]為毛茛科烏頭屬植物，主要分布在甘肅、青海、四川、陜西、寧夏、山西等地。別名火焰子、蔓烏藥、羊角七、藤烏藥。民間用于治療跌打損傷、類風濕性關節炎引起的疼痛和紅腫等癥狀[2-5]。本課題組在前期對其化學成分及藥效學方面進行了試驗研究，發現松潘烏頭的有效成分總生物堿，表現出較強的鎮痛、抗炎作用。為了深入研究開發松潘烏頭的可利用價值，以富集確定有效部位為目的，本實驗采用大孔樹脂對其總生物堿提取純化工藝進行研究，提高其生物堿量，為下一步制劑研究以及新藥申報等方面的工作提供研究依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 松潘烏頭(AconitunsungpanenseHand-Mazz) 采自甘肅天水，由甘肅林業職業技術學院任繼文教授鑒定。

1.2 儀器及試劑 KQ-500M超聲波清洗儀(東莞市科橋超聲波設備有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任有限公司)；YP502N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；烏頭堿對照品(中國食品藥品檢定研究院)；氨水(分析純)；硫酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；三氯甲烷(分析純)；乙醚(分析純)；溴甲酚綠(分析純)；冰醋酸(分析純)；無水硫酸鈉(分析純)；D101、AB-8、X-5、D-001(安徽三星樹脂公司)；NKA-9(天津波鴻樹脂科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 松潘烏頭總生物堿的制備 稱取粉碎后過60目篩的松潘烏頭藥材200 g，置提取設備中，用10%碳酸鈉溶液潤濕，拌勻，放置4 h，加入75%的乙醇1 000 mL，充分攪拌，功率為500 W超聲提取[6]30 min，重復操作3次，合并提取液，減壓回收乙醇得松潘烏頭總生物堿浸膏。

2.2 總生物堿測定(酸性染料比色法)[7-8]

2.2.1 烏頭堿對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對照品0.029 8 g，置100 mL量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，即得烏頭堿對照品質量濃度為0.298 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取“2.1”項制備的松潘烏頭總生物堿浸膏2 g，置100 mL量瓶中用0.01 moL的鹽酸溶解并稀釋至刻度，即得松潘烏頭總生物堿質量濃度為20 mg/mL。

2.2.3 測定波長的選擇 精密吸取烏頭堿對照品溶液及供試品溶液各1.0 mL，置于具塞試管中，加氨試液0.5 mL，用乙醚∶三氯甲烷(體積比3∶1)4 mL提取兩次，合并提取液，蒸干，殘留物加0.01 mol/L鹽酸1.0 mL溶解，加pH 3.05的醋酸鹽緩沖液5.0 mL與溴甲酚綠指示液2.0 mL，搖勻，再精密加人三氯甲烷8.0 mL，充分振搖，靜置，分取三氯甲烷層，加無水Na2SO4脫水后，以0.01 mol/L鹽酸同法作空白。分別在200～800 nm波長范圍內進行掃描。結果表明，烏頭堿對照品和供試品溶液在416 nm處均有最大吸收，故選擇416 nm為檢測波長。

2.2.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，置于具塞試管中，再分別補加0.01 mol/L的鹽酸0.9、0.75、0.5、0.25、0 mL之后，按照波長選擇的方法，以0.01 mol/L鹽酸同法作空白在416 nm下測定吸光度。以烏頭堿對照品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.191 2x-0.008 8,r2=0.999 8，線性范圍為0.029 8～0.298 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密量取0.298 mg/mL烏頭堿對照品溶液1.0 mL，置于具塞試管中，參照“2.2.4”項下方法操作，于416 nm處測定吸光度，連續測定6次。結果RSD為0.73%，說明儀器所測數據準確可靠。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一批制備的松潘烏頭總生物堿浸膏6份，各2 g，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法操作，于416 nm處測定吸光度，結果RSD為0.89%。表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下制備的供試品溶液1.0 mL，按“2.2.4”項下方法操作，顯色后分別在0、5、15、25、35、45、55 min于416 nm處測定吸光度，RSD為0.75%。結果表明，該方法在55 min內穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取6份“2.2.2”項下制備的供試品溶液各1.0 mL，分別精密加入1.0 mL烏頭堿對照品溶液(0.298 mg/mL)，混勻，比色法測定吸光度。根據回歸方程計算回收率。烏頭堿的平均回收率為99.8%，RSD為2.46%。

2.2.9 樣品的測定 定量取上柱后的洗脫液旋轉蒸干，殘留物加定量的0.01 mol的鹽酸溶解，按上述烏頭堿對照品的處理方式進行測定。

2.3 大孔樹脂純化松潘烏頭生物堿

2.3.1 大孔樹脂的預處理 用體積分數為95%乙醇將樹脂浸泡24 h，使其充分溶脹，然后用乙醇清洗至洗出液與水混合(體積比1∶5)無白色渾濁后，再用大量蒸餾水洗去乙醇，備用。

2.3.2 大孔樹脂的篩選 通過靜態吸附法對D101、X-5、AB-8、NKA-9及D-001型樹脂進行篩選，確定純化松潘烏頭生物堿的樹脂類型[9]。具體操作如下：精密稱取10 g樹脂D101、X-5、AB-8、NKA-9及D-001，經過預處理之后分別置于100 mL錐形瓶中，加入過量松潘烏頭生物堿提取液，室溫條件下振搖24 h，使之充分吸附。測定吸附后松潘烏頭生物堿提取液中總生物堿的量。將靜態吸附飽和的樹脂，加體積分數為95%的乙醇溶液，在室溫條件下振搖24 h，測定乙醇中生物堿的量。重復3次，根據測定的結果，計算各樹脂的平均靜態吸附率與解吸附率，結果見表1。

表1 樹脂的吸附率與洗脫率

由表1可見，大孔吸附樹脂D101的飽和吸附量及洗脫率均優于其余樹脂，因此，選擇D101樹脂進行工藝參數考察。

2.3.3 單因素試驗 將預處理后的D101樹脂裝入D3.5 cm × 30 cm的玻璃柱中，樹脂填裝高度為20 cm，水洗至無醇味。考察上樣液質量濃度、上樣液pH、洗脫液質量濃度及洗脫液pH，對D101大孔樹脂吸附性能及洗脫參數的影響。

2.3.3.1 上樣液質量濃度的考察 將5份定量的松潘烏頭總生物堿提取液分別稀釋成0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 g/mL，以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應產生橘紅色沉淀泄漏；待吸附飽和之后測定吸附剩余液中總生物堿的量，重復3次，根據測定的結果，計算各質量濃度下平均吸附量，結果見表2。

表2 松潘烏頭生物堿提取液質量濃度對D101吸附量的影響

表2表明，隨著松潘烏頭生物堿提取液質量濃度的增大，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量逐漸增加，當質量濃度為0.20 g/mL，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量達到29.49 mg/g，此后質量濃度增加，吸附量沒有顯著增加，說明質量濃度為0.2 g/mL時，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量已接近飽和。因此，在D101動態吸附松潘烏頭生物堿的實驗中，最佳質量濃度為0.2 g/mL。

2.3.3.2 上樣液pH的考察 取3份等量的松潘烏頭總生物堿提取液，用氨水分別調pH于4、5、6之后定容，使其質量濃度為0.20 g/mL，以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應產生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后測定吸附剩余液中總生物堿的量。重復3次，根據測定的結果，計算不同上樣液pH下平均吸附量，結果見表3。

表3 松潘烏頭生物堿提取液pH對D101吸附量的影響

表3表明，松潘烏頭總生物堿提取液的pH為5時，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量達到最高30.12 mg/g，所以本實驗選擇總生物堿提取液的pH為5時上樣。

2.3.3.3 洗脫液pH的考察 取4份0.2 g/mL、pH5的松潘烏頭總生物堿提取液，分別以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應產生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后，用蒸餾水以2 BV/h的體積流量對雜質進行洗脫，再分別用pH為4、5、6、7，體積分數為95%的乙醇以2 BV/h的體積流量對總生物堿進行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總生物堿的量。重復3次，計算其平均值，結果見表4。

表4 洗脫液pH對生物堿純化率的影響

表4表明，洗脫液pH從4增加到6，洗脫液中總生物堿的量也隨之增大；而pH從6增加到7，洗脫液中總生物堿的量反之降低；隨著pH的變化，洗脫率沒有明顯的變化；因此，此實驗選擇洗脫液pH為6進行洗脫。

2.3.3.4 洗脫液體積分數的考察 取5份0.2 g/mL、pH5的松潘烏頭總生物堿提取液，分別以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應產生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后用5 BV的蒸餾水以2 BV/h的體積流量對雜質進行洗脫，再用pH為6、體積分數為40%、50%、60%、75%、95%的乙醇以2 BV/h的體積流量對總生物堿進行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總生物堿的量。平行3組，計算平均值，結果如下表所示：

表5 洗脫液體積分數對生物堿純化率的影響

表5表明，體積分數為75%的乙醇洗脫液中總生物堿的量較高，而40%、50%、60%、95%的洗脫液中總生物堿含量相差不大；洗脫率隨著乙醇洗脫液體積分數的增加而增大，故確定洗脫液的體積分數為75%。

2.3.4 響應面試驗

2.3.4.1 響應面試驗設計及結果 根據單因索試驗結果，選取上樣液pH、上樣液質量濃度、乙醇體積分數等3個因素進行試驗設計結果見表6。

表6 響應面實驗法因素和水平

2.3.4.2 響應面分析方案及結果 結合單因素試驗結果，進行BoX-Behnken中心組合實驗設計，利用Design-Expert 7.0軟件進行數據擬合，建立數學模型，并獲得大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿工藝的最佳條件，響應面分析試驗設計方案與試驗結果見表7。

2.3.4.3 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert 7.0 軟件對表7試驗數據進行多元回歸擬合，得到生物堿量(Y)對上樣液pH(A)、上樣液質量濃度(B)、乙醇體積分數(C)的二次多項回歸模型為：

Y=222.96-4.43A-2.57B+0.45C-5.64AB+5.92AC-0.68BC-31.52A2-13.97B2-17.87C2

對該模型方程求一階偏導數等于零，求出最佳條件為：上樣液pH為5.0、上樣液質量濃度為0.2 g/mL、洗脫液乙醇的體積分數為75%。該回歸模型進行方差分析，結果見表8。

根據統計學相關知識對方差分析表進行分析，模型的P<0.000 1，模型失擬項(P=0.125 5)不顯著，說明可以用該模型來分析和預測大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的工藝結果。從回歸方程模型因變量的方差分析可知：模型的一次項A差異顯著；交叉項AB、AC差異顯著；二次項A2、B2、C2差異極顯著，說明所選因素與響應值之間不是簡單的線性關系。依據回歸方程的系數值和方差分析表可知，在響應面的試驗范圍內因素的主效應關系為：上樣液pH>上樣液質量濃度>洗脫液體積分數。

表7 響應面方案及試驗結果

表8 回歸模型方差分析

2.3.4.4 響應曲面分析 由多元回歸方程可以得到不同因素對成分量影響的響應面及其等高線圖。等高線圖表示在同一橢圓形的曲線上，生物堿的量是相同的。在橢圓形區域中心，生物堿量最高，由中心向邊緣逐漸降低。響應曲面坡度越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變非常敏感，而曲面坡度相對平緩，表明操作條件的改變對響應值的改變會比較小。根據上述性質可以看出：上樣液質量濃度與上樣液pH，上樣液pH與洗脫液體積分數存在明顯的交互效應，而上樣液質量濃度與洗脫液體積分數交互效應不明顯。見圖1～圖3。

2.3.4.5 最優工藝條件求取與驗證 通過Design-Expert 7.0軟件求得大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的最佳工藝條件如下：上樣液質量濃度為0.2 g/mL，上樣液pH為5.0，洗脫液體積分數為75%，在此條件下進行6次驗證試驗，則松潘烏頭總生物堿的平均含有量為223 mg/g，RSD為1.78%。表明實驗設計和響應面法優化得到的提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

圖1 上樣液質量濃度和上樣液pH對純化率的影響

圖2 上樣液pH和洗脫液體積分數對純化率的影響

圖3 上樣液質量濃度和洗脫液體積分數對純化率的影響

3 討論

本實驗采用大孔吸附樹脂D101，通過單因素試驗和響應面回歸分析法，達到了純化松潘烏頭總生物堿的工藝目的。考察了上樣液質量濃度、上樣液pH值、洗脫液體積分數和洗脫液pH對大孔吸附樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的影響，響應面法研究表明大孔吸附樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的最佳工藝條件為：松潘烏頭提取液質量濃度為0.2 g/mL，pH為5.0，乙醇洗脫體積分數為75%，在此條件下松潘烏頭含有量為22%，工藝簡便，參數穩定可靠，因此，大孔吸附樹脂D101適宜于松潘烏頭總生物堿的分離純化，通過中試研究可應用于工業生產，也為相關研究的進一步開展提供了可靠的實驗依據。

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