離子對色譜法同時測定益母草片中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿

符滇海， 馮 葉， 劉秋雨， 盧蓉娜

(佛山市順德區(qū)藥品檢驗所，廣東 順德 528300)

益母草片為益母草制成的片劑，功能主治活血調(diào)經(jīng)，用于月經(jīng)量少。目前其質(zhì)量標準[1]以鹽酸水蘇堿為定量指標，用重量法測定其含有量。該方法分析步驟多，反應(yīng)時間長，試驗條件嚴格，大大影響了該檢驗速度和準確性。除此之外，也有采用高效液相色譜法[2-5]，但由于保留時間過短、色譜柱不通用或峰形不理想，加之鹽酸水蘇堿具有的特殊的分子結(jié)構(gòu)，不適用于益母草片的定量測定。本方法采用C18柱梯度洗脫同時測定鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿，使用普通試劑，采用獨特的樣品預(yù)處理方法，克服了現(xiàn)有質(zhì)量標準的弱點。

1 儀器與試藥

Dionex U3000高效色譜儀，二極管陣列檢測器；昆山KQ-300DA型超聲振蕩器(功率300 W,頻率40 kHz),鹽酸水蘇堿化學對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110712-201010，純度為99.9%)，鹽酸益母草堿化學對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111823-201202，純度為94.7%)，益母草片(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號分別為101101、110903、110904)。陰性輔料空白(廣東環(huán)球制藥有限公司提供)乙腈為色譜純，十二烷基硫酸鈉(化學純)、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉(以上4種離子對試劑均為色譜專用)、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為0.010 mol/L辛烷磺酸鈉溶液(用磷酸溶液調(diào)至pH至2.0)-乙腈，梯度洗脫(0～10 min，10%乙腈；10～15 min,10%～24%乙腈；15～25 min,24%乙腈；35～40 min,4%～10%乙腈,40～50 min,10%乙腈)；檢測波長為192 nm(鹽酸水蘇堿)，218 nm(鹽酸益母草堿)；體積流量為1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 取10片益母草片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱定1.972 8 g(約相當于鹽酸水蘇堿45 mg)，置100 mL量瓶中，70%乙醇約70 mL，超聲45 min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，加在酸性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，濕法裝柱)上，用水20 mL洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，用70%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL的量瓶中，定容，搖勻，濾過，即得。

2.3 對照品制備 取鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿對照品適量，精密稱定，加70%乙醇溶解，分別制成每1 mL約含0.25 mg、7.0 μg和0.35 mg、9.0 μg的兩份混和對照品溶液。用兩點校正法計算。

2.4 線性關(guān)系 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，用70%乙醇溶解得到質(zhì)量濃度為914.5 μg/mL貯備液，分取制得18.29、36.57、91.43、182.86、274.30、548.58、914.30 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以質(zhì)量濃度(x)為自變量，峰面積(y)為因變量，得到回歸方程為y=1.720 3x+3.213，r=0.999 96(n=7)。結(jié)果鹽酸水蘇堿在18.29～914.30 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密稱取鹽酸益母草堿對照品適量，用70%乙醇溶解得到質(zhì)量濃度為32.26 μg/mL貯備液，分取制得0.645 3、1.613、3.226、6.453、12.91、19.36、32.26 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以質(zhì)量濃度為自變量，峰面積為因變量，得到回歸方程y=44.86x-4.70，r=0.999 97(n=7)結(jié)果鹽酸益母草堿在0.645 3～32.26 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取“2.3”項下的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，重復(fù)測定6次，按峰面積及出峰時間計算精密度，鹽酸水蘇堿峰面積的RSD為0.2%，保留時間的RSD為0.04%，鹽酸益母草堿峰面積的RSD為0.3%，保留時間的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品溶液置于室溫，分別于0、2、4、6、8、14 h內(nèi)按“2.1”項下的色譜條件進行測定。以峰面積計算鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿成分相對標準偏差RSD分別為0.7%、0.6%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904，含鹽酸水蘇堿15 mg/片)分別按“2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，鹽酸水蘇堿為標示量59.6%，RSD為0.9%。鹽酸益母草堿0.288 mg/片，RSD為0.5%。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904，含鹽酸水蘇堿15 mg/片)9份，折合為鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的量，置25 mL的量瓶中，并精密加入不同體積的同一質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.2”項下的方法處理，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同的供試品溶液。按“2.1”項下的色譜條件進行測定，結(jié)果鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的平均回收率分別為99.7%(RSD 1.4%)、98.2%(RSD 0.7%)。見表1、2。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收率試驗

表2 鹽酸益母草堿加樣回收率試驗

2.9 樣品測定 取樣品(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904：含鹽酸水蘇堿15 mg/片)，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，以外標法計算鹽酸水蘇堿的量。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 鹽酸水蘇堿譜圖(192 nm)

圖2 鹽酸益母草堿色譜圖(218 nm)

用同樣的方法對該品種項下的3個批次(101101，110903，110904)樣品進行了測定。結(jié)果鹽酸水蘇堿分別為標示量65.1%(n=3,RSD為0.9%)、58.2%(n=3,RSD為0.7%)、59.6%(n=6,RSD為0.9%)；鹽酸益母草堿分別為0.278 mg/片(101101)(n=3,RSD為0.4%)、0.283 mg/片(110903)(n=3,RSD為0.5%)、0.288 mg/片(110904)(n=6,RSD為0.5%)。而用國家標準方法[1]測定得鹽酸水蘇堿的百分標示量分別為100.8%(101101)、98.3%(110903)和98.2%(110904)(該數(shù)據(jù)由廣東環(huán)球制藥有限公司提供)(標準規(guī)定，每片含鹽酸水蘇堿(C7H13NO2·HCl)應(yīng)為標示量的90.0～110.0%)。由此可見，本方法與國家藥品標準方法相比，測定結(jié)果有較大的出入。

3 討論

3.1 流動相離子對試劑的選擇 將十二烷基硫酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉配成相同摩爾濃度的離子對溶液，在相同p H2的條件下，按相同流動相比例進樣，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有離子對試劑都能使樣品出現(xiàn)色譜峰戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉作為離子對試劑，鹽酸水蘇堿保留時間過早；十二烷基硫酸鈉在此流動相比例下不能完全溶解，且過濾后的流動相保留時間過長，峰形拖尾；辛烷磺酸鈉較庚烷磺酸鈉保留時間較長，有利于流動性比例的調(diào)整。且辛烷磺酸鈉作為流動相基線較穩(wěn)，空白進樣在主峰相應(yīng)的位置上無干擾；當水系流動相中辛烷磺酸鈉的濃度為10 mmol/L時，鹽酸水蘇堿色譜峰的理論塔板數(shù)和對稱性較理想。且該色譜條件與《中國藥典》2010年版[2]收載的鹽酸益母草堿方法相近，所以通過梯度洗脫可完成鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的同時測定，效果良好。

3.2 流動相的pH值選擇 以10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液-乙腈(90∶10)為流動相，將水系和有機系混合后，用磷酸調(diào)pH，考察了pH從5.0～2.0對鹽酸水蘇堿色譜圖的色譜行為的影響，隨著pH的降低，保留時間也隨著增加，在pH約為2時，保留時間變得穩(wěn)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pH在2時，在此條件下，能很好地滿足分析要求。

3.3 樣品的制備 我們參考了《中國藥典》[2]的提取方法并結(jié)合了藥品的制備工藝，采用70%乙醇為提取溶劑，和原標準中以0.1 moL/L鹽酸提取效果一樣，超聲提取30 min與回流提取相同時間效果也一致，且濃度不再增加，因此采取提取時間為45 min比較合適。采用氧化鋁過柱，以水為洗脫液，鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿對照品溶液無損失，樣品的回收率均很高，且能去除大部分干擾雜質(zhì)。試驗發(fā)現(xiàn)，使用酸性氧化鋁去除雜質(zhì)效果最佳。

3.4 方法耐用性考察 對不同廠牌型號的色譜柱進行了考察，其中有Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、phnomenex Luna 5 μm C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，均能得到柱效高，對稱性較好的色譜圖，且峰面積基本一致。表明本方法通用性、耐用性、重復(fù)性均良好。

3.5 測定結(jié)果討論 該方法與國家標準方法[1]測定存在較大的出入。究其原因，在國家標準中使用的與鹽酸水蘇堿起沉淀反應(yīng)的試劑硫氰酸鉻銨溶液，可能與藥品中的其他物質(zhì)也產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)，致使其比用高效液相法測得的值高出許多。同時還考察了按國家標準方法(10片置50 mL的量瓶中)與本實驗“2.2”項供試品制備進行了比較，發(fā)現(xiàn)用本方法測得的含有量結(jié)果基本一致。說明國家標準以鹽酸水蘇堿作為質(zhì)量指標存在較大誤差。

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