主要堿性蛋白與氣道高反應性關系的研究進展

王海濤，方以群

氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)是過敏性哮喘的顯著特點，可直接導致哮喘患者氣管平滑肌和支氣管發生過度收縮，引發一系列以小支氣管明顯痙攣收縮為特征的臨床病癥［1］。主要堿性蛋白(major basic protein，MBP)是一種活化嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)脫顆粒產生的低分子量、高陽離子蛋白，是包括支氣管哮喘在內的多種氣道炎癥性疾病的主要標志物之一［2］。MBP能夠通過抑制神經元M2型毒蕈堿受體(muscarinic M2receptor，M2R)功能，引發大量乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的釋放，導致支氣管收縮和AHR。本綜述對MBP結構、功能作用及其與AHR的關系等的研究情況進行介紹。

1 MBP的結構

MBP不僅存在于EOS，而且在肥大細胞和嗜堿性粒細胞內也有一定表達。人類MBP基因序列定位在11號染色體，人類MBP與豚鼠MBP抗血清存在交叉反應性，兩者的單克隆抗體也存在＞86%的交叉反應性。

MBP是一個序列特征不顯著的C型凝集素(CTL)超家族成員。人MBP包含117個氨基酸殘基，其中有17個精氨酸殘基和7個賴氨酸殘基，還含有9個半胱氨酸殘基［3］。MBP最初是以1個含222個氨基酸殘基的前體蛋白形式(pro-MBP)合成的，包含1個16-氨基酸殘基信號肽、89個氨基酸殘基前體片段和含117個氨基酸殘基。在pro-MBP胞內轉運至進行蛋白酶解加工過程和MBP儲存在EOS顆粒期間，強酸性前體片段發揮了中和基本MBP結構域作用的效能。第1基因座控制區(pro-MBP 123～150氨基酸殘基)主要有顯著細胞毒性;第2基因座控制區(pro-MBP 194～222氨基酸殘基)在促進嗜堿性粒細胞釋放組胺方面更具高效性［4］。pro-MBP在細胞質顆粒中水解生成14 kD MBP，儲存在EOS分泌性“特異”顆粒的高電子密度的結晶核心。EOS活化后，MBP被分泌到分泌小泡，逐步以脫顆粒的形式釋放［5］。

2 MBP對呼吸系統的病理生理作用

MBP對腫瘤細胞及脾臟、腸道、內皮細胞、氣道上皮細胞等哺乳動物的多種細胞有毒性作用。MBP能激活組胺釋放和減弱細胞免疫應答，促進炎癥進程。MBP能夠引發氣道上皮細胞損傷，增加氣道上皮細胞前列腺素合成，誘導嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放組胺，介導氣道平滑肌收縮，加速氣道水腫發生，提高氣道對致痙原的反應性等。Kato等［6］的研究表明，MBP可損傷呼吸道合胞體病毒感染的支氣管上皮細胞，說明MBP與呼吸道合胞體病毒感染誘發的哮喘急性加重有關。

MBP是M2R選擇性、內源性變構拮抗劑。肺臟含有M2R、M3型毒蕈堿受體(M3R)等多種亞型毒蕈堿受體。肺的副交感神經末稍釋放的ACh激活M3R，作用于氣道平滑肌，引發其收縮，導致支氣管收縮。同時，副交感神經的ACh釋放到神經末梢時會受到M2R的抑制作用。應用選擇性拮抗劑阻斷神經性M2R的負反饋抑制作用，可8～10倍地增大電刺激迷走神經引發的支氣管收縮效果。相反，應用毛果蕓香堿興奮M2R可降低上述效果的80%［7］。MBP能夠顯著增強肺C纖維對于肺膨脹和化學性刺激的敏感性。C型輸入神經纖維激活后，輸入感受器編碼以動作電位形式的神經沖動傳至中樞神經系統，誘發肺化學反射(包括呼吸暫停、心動過緩和低血壓)和其他諸如支氣管收縮、支氣管血管舒張、呼吸困難和咳嗽等心肺反射［2］。MBP通過增強內向電流及動作電位的途徑對肺感覺神經元發揮直接的電荷依賴的長效致敏效應，導致在病理生理條件下發生與EOS氣道滲入有關的AHR。75%迷走神經的支氣管肺傳入纖維是無髓鞘(C類)纖維，興奮后能引發支氣管收縮、黏液分泌過多及其他由膽堿能反射和內源性速激肽類介導的對氣道功能的影響［8］。MBP可引起肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺、活化嗜中性粒細胞和肺泡巨噬細胞，直接與哮喘的上皮細胞損害、支氣管痙攣等相關。向猴子肺內灌注MBP，除了可引起支氣管痙攣外，還可使支氣管高反應性增高10倍［9］。另外，MBP還可通過蛋白激酶C和細胞內Ca2+介導II型肺泡壁細胞對磷脂酰膽堿的分泌［10］。

3 MBP表達的影響因素

MBP mRNA的表達水平隨著EOS的發育而逐步增加，隨著EOS的成熟而減少。EOS始于造血干細胞和骨髓祖細胞的分化過程，最初受白細胞介素3(IL-3)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5的調控;隨后，IL-5特異地影響EOS的終末分化、功能激活等。

EOS經CC-基序趨化因子受體3(CCR3)激動劑募集到氣道神經周圍及經細胞內細胞黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子(VCAM)黏附到氣道神經上，通過鈣內流、增加CD11和CD18表達、活化ERK和p38 MAPK、增加生成活性氧、肌動蛋白聚合和脫顆粒及EOS活化趨化因子、P物質、ICAM-1和VCAM等激活EOS，釋放MBP。除EOS活化趨化因子外，EOS活化趨化因子-2，-3、單核細胞趨化蛋白-2，-3，-4、RANTES、CCL15和CCL28等與CCR3結合的趨化因子也可能參與了對EOS的激活過程［11］。

ICAM-1和EOS活化趨化因子是EOS化學誘導至神經的關鍵因子。TNF-α能上調EOS活化趨化因子和ICAM-1的表達，還能增加 IL-5的表達和降低 M2R mRNA穩定性。TNF-ɑ可能間接增加EOS增殖，遷移和黏附到副交感神經上，促進EOS募集反應，增加生成MBP，抑制M2R功能［12］。

另外，GM-CSF、IL-1、IL-3、IL-5可能對EOS有不同程度的活化作用。Meyts等［13］研究顯示，IL-12抗體可降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CD4+T細胞數量和IL-4、IL-5、IL-13水平及肺IL-10、EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA表達水平;在氣道激發階段通過干擾素 γ介導，減低 EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA的表達水平，說明IL-12很可能通過上述細胞因子影響MBP的生成。

除上述影響因素外，EOS顆粒發育基因(eosinophil granule ontogeny，EGO)——一種新發現的非編碼RNA表達基因被沉默后，MBP mRNA的表達水平僅為對照的9%，表明EGO是MBP基因正常轉錄表達的一個必要因子［14］。另外，GATA-2在MBP P2啟動子反式激活過程中充當了GATA-1的競爭性抑制劑，也能抑制GATA-1約50%活性，發揮對MBP表達的負向調節作用。

4 MBP調控的細胞因子

MBP可顯著上調ET-1、TGF-ɑ、TGF-β1、EGFR、PDGF-β、MMP-9、腱糖蛋白和纖維連接蛋白的mRNA表達水平，下調MMP-1基因表達水平，促進MMP-1、MMP-9、ET-1、PDGF-AB蛋白分子生成，在支氣管上皮修復、肺氣管結構重塑、誘導成纖維細胞分化為成肌纖維細胞及調控氣道平滑肌細胞增殖、趨化、激活、細胞外基質的更新、降解等過程中發揮重要作用。MBP還可與IL-1ɑ和TGF-β1協同增加IL-6類細胞因子mRNA和蛋白質的生成量［15］。

MBP能誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞組胺釋放、EOS和成纖維細胞IL-8分泌、前列腺素和離子分泌，與哮喘等變態反應性疾病的介導機制有關。在氣道上皮細胞，MBP可增加前列腺素E2和F2ɑ的合成，減弱纖毛運動性，誘發細胞損傷［16］。MBP可激活上皮細胞表面的鈣感受器，促進成纖維細胞生長因子9生成，導致基底細胞增生［17］。Page等［18］研究表明，MBP可有效刺激中性粒細胞，通過調控IL-8的基因轉錄增加生成IL-8，導致急性哮喘及其他炎癥性肺疾病的發生。MBP也能短暫升高MIP-1α和MIP-1β mRNA表達水平，但未能促進MIP-1α或MIP-1β的蛋白生成量。

5 MBP與AHR的關系及其在病理過程中的作用

在絕大多數動物中，氣道M2R的含量明顯高于M3R(由于動物種系不同，M2R含量為毒蕈堿性受體總量的50%～80%)。經檢測M2R和M3R mRNA存在于人類支氣管中［1］。M2R功能的降低與病毒感染、變應原激發、臭氧暴露、有機磷酸鹽暴露和哮喘病理過程中發生的AHR密切相關。應用肝素中和MBP對M2R的拮抗作用，快速恢復M2R功能可有效逆轉 AHR［19］。氣管內滴入 MBP可誘發支氣管收縮和AHR［8］。依那西普、地塞米松可通過抑制EOS募集至氣道神經周圍，保護神經元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR的發生［12，20］。

AHR的主要機制是MBP阻斷副交感神經M2R對ACh釋放的抑制功能，增加釋放到氣道平滑肌上M3R的ACh量和增強迷走神經誘發的支氣管收縮。阻斷M2R功能可5～10倍地增大迷走神經誘發的支氣管收縮。EOS經CCR3激動劑募集到氣道神經周圍，經ICAM-1、VCAM黏附到氣道神經上，釋放MBP。阻斷或抑制EOS向肺的遷移及阻斷MBP抑制功能均能有效保護M2R功能，阻止AHR發生。

在正常生理條件下，副交感神經末梢對ACh的釋放受M2R抑制。ACh或毛果蕓香堿等毒蕈堿激動劑興奮M2R，通過抑制ACh的釋放減輕迷走神經誘發的支氣管收縮。相反，M2R功能的喪失或被拮抗劑阻斷將導致ACh釋放增多，增強誘發支氣管收縮。MBP抗體阻止了M2R功能障礙及其相關的AHR的發生，說明是MBP阻遏了神經元M2R功能，導致了AHR。在急性副流感病毒感染、變應原致敏和激發及臭氧的急性暴露所導致的哮喘中，肺副交感神經上的M2R均發生了功能障礙，表明M2R功能缺失是AHR重要的病理機制。MBP可阻遏M2R功能，顯著增加ACh釋放量，增大10倍迷走神經誘發的支氣管收縮效果［1］。在致命性哮喘患者和變應原激發的動物模型的氣道神經周圍，活化的EOS簇生成群，脫顆粒生成MBP，阻斷M2R功能消除對ACh釋放的負反饋性調控作用，增加氣道張力和增強迷走神經介導的支氣管收縮。EOS在M2R功能缺失和繼發的AHR的病理過程中發揮了特有的作用［11］。另外，M2R還能經活化的腺苷酸環化酶抑制平滑肌舒張，增加釋放的ACh可能進一步增強M2R介導對腺苷酸環化酶的抑制作用。當然，M2R的合成減少也可能是其功能降低的病理機制［1］。

另外，氣道平滑肌內的M3R經百日咳病毒毒素肺敏感性G蛋白(GTP-結合調節蛋白)與磷脂酶C偶聯，激活的磷脂酶C再催化由膜磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成肌醇三磷酸、二酰甘油和經激活的蛋白激酶發生蛋白質磷酸化，也可介導氣道平滑肌收縮［1］。

6 結束語

EOS募集到氣道神經，活化后釋放MBP，抑制M2R對副交感神經ACh釋放的負性調節作用，引起ACh釋放明顯增多，作用于氣道平滑肌上M3R，導致發生AHR。顯而易見，EOS(特別是活化的EOS)和MBP與AHR直接相關。但是，以往研究在哪些檢測指標能較為準確地反映三者之間關系的問題上存在一定的分歧。有研究表明，在支氣管哮喘的病理生理過程中，EOS脫顆粒的意義要遠大于其數量的增多［21］。AHR與BALF或氣道組織中的EOS含量沒有直接相關性，但與沉積在氣道和氣道神經周圍的MBP和活化EOS的含量密切相關。相一致的是，Evans等［20］的研究表明，地塞米松在通過抑制EOS募集至氣道神經周圍，保護神經元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR發生時，并沒有引起BALF中EOS含量變化。Yost等［19］的實驗結果還顯示，豚鼠在臭氧暴露后，肺EOS數量在14 h開始減少;隨后在48 h開始明顯增多，至少維持至少4 d，說明EOS數量并不是維持不變的，而是隨著病程演進反復變化的。相反，Homma等［22］研究卻表明，BALF中EOS數量和MBP水平與哮喘的嚴重程度具有相關性。在死因為哮喘持續狀態的患者中，MBP存在于受損上皮細胞的表面和氣道黏膜和黏液中，完全抑制呼吸上皮纖毛運動和對呼吸上皮造成毒性損害，發生AHR，表明嚴重哮喘與氣道管腔內EOS和MBP存有重要的關聯。

筆者認為，在研究EOS、MBP與AHR關系及其相關的呼吸系統疾病時，應盡量以氣道黏膜、神經周圍蛋白分子(EOS應以在氣道神經周圍活化的EOS作為檢測指標)及其基因表達作為主要依據，而以其在BALF、組織及血漿中的表達結果作為參考，進行MBP相關性分子生物學功能及機制的研究，才能獲得可信度高的實驗結果。

［1］Fryer AD，Jacoby DB.Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，158(Suppl 2):S154-S160.

［2］Gu Q，Lim ME，Gleich GJ，et al.Mechanisms of eosinophil major basic protein-induced hyperexcitability of vagal pulmonary chemosensitive neurons［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，296(3):L453-L461.

［3］Thomas LL，Kubo H，Loegering DJ，et al.Peptide-based analysis of amino acid sequences important to the biological activity of eosinophil granule major basic protein［J］.Immunol Lett，2001，78(3):175-181.

［4］Glerup S，Kl?verpris S，Oxvig C.The proform of the eosinophil major basic protein binds the cell surface through a site distinct from its C-type lectin ligand-binding region［J］.J Biol Chem，2006，281(42):31509-31516.

［5］Melo RC，Spencer LA，Perez SA，et al.Vesicle-mediated secretion of human eosinophil granule-derived major basic protein(MBP)［J］.Lab Invest，2009，89(7):769-781.

［6］Kato M，Ishioka T，Kita H，et al.Eosinophil granular proteins damage bronchial epithelial cells infected with respiratory syncytial virus［J］.Int Arch Allergy Immunol，2012，158(Suppl 1):11-18.

［7］Jacoby DB，Gleich GJ，Fryer AD，et al.Human eosinophil major basic protein is an endogenous allosteric antagonist at the inhibitory muscarinic M2receptor［J］.J Clin Invest，1993，91(4):1314-1318.

［8］Gu Q，Wiggers ME，Gleich GJ，et al.Sensitization of isolated rat vagal pulmonary sensory neurons by eosinophil-derived cationic proteins［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(4):L544-L552.

［9］Swaminathan GJ，Weaver AJ，Loegering DA，et al.Crystal structure of the eosinophil major basic protein at 1.8［J］.J Biol Chem，2001，276(28):26197-26203.

［10］Manabu O，Kai H，Shinozawa S，et al.Effects of eosinophil granule major basic protein on phosphatidylcholine secretion in rat type II pneumocytes［J］.Am J Physiol，1999，276(5Pt 1:L763-L768.

［11］Fryer AD，Stein LH，Nie Z，et al.Neuronal eotaxin and the effects of CCR3 antagonist on airway hyperreactivity and M2 receptor dysfunction［J］.J Clin Invest，2006，116(1):228-236.

［12］Nie Z，Jacoby DB，Fryer AD.Etanercept prevents airway hyperresponsiveness by protecting neuronal M2muscarinic receptors in antigen-challenged guinea pigs［J］.Br J Pharmacol，2009，156(1):201-210.

［13］Meyts I，Hellings PW，Hens G，et al.IL-12 Contributes to Allergen-Induced Airway Inflammation in Experimental Asthma［J］.J Immunol，2006，177(9):6460-6470.

［14］Wagner LA，Christensen CJ，Dunn DM，et al.EGO，a novel，noncoding RNA gene，regulates eosinophil granule protein transcript expression［J］.Blood，2007，109(12):5191-5198.

［15］Pe'gorier S，Wagner LA，Gleich GJ，et al.Eosinophil-derived cationic proteins activate the synthesis of remodeling factors by airway epithelial cells［J］.J Immunol，2006，177(7):4861-4869.

［16］Wylam，ME，Gungor N，Mitchell RW，et al.Eosinophils，major basic protein，and polycationic peptides augment bovine airway myocyte Ca2+mobilization［J］.Am J Physiol，1998，274(6 Pt 1):L997-L1005.

［17］Mulder DJ，Pacheco I，Hurlbut DJ，et al.FGF9-induced proliferative response to eosinophilic inflammation in oesophagitis［J］.Gut，2009，58(2):166-173.

［18］Page SM，Gleich GJ，Roebuck KA，et al.Stimulation of neutrophil interleukin-8 production by eosinophil granule major basic protein［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1999，21(2):230-237.

［19］Yost BL，Gleich GJ，Jacoby DB，et al.The changing role of eosinophils in long-term hyperreactivity following a single ozone exposure［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289(4):L627-L635.

［20］Evans CM，Jacoby DB，Fryer AD.Effects of dexamethasone on antigen-induced airway eosinophilia and M Receptor dysfunction［J］.Am J Respir Crit Care Med，2001，163(6):1484-1492.

［21］Kim CK，Callaway Z，Kim DW，et al.Eosinophil degranulation is more important than eosinophilia in identifying asthma in chronic cough［J］.J Asthma，2011，48(10):994-1000.

［22］Homma T，Bates JH，Irvin CG.Airway hyperresponsiveness induced by cationic proteins in vivo:site of action［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289(3):L413-L418.

(本文編輯:甘輝亮、莫琳芳)