結核病實驗室診斷技術研究進展

董玉霞 閆寶環 彭景麗 鮑云波 沈顏紅

結核病是一個全球性的重要的公共衛生問題，根據WHO統計，每年全球約300萬人死于結核病。尤其是在最近十年，結核病在全球疫情又呈上升趨勢，對一些國家已構成嚴重的健康威脅。因此，找到一種快速、特異的診斷方法，以控制結核病的傳播具有重要的意義。近年來隨著對結核病的研究的不斷深入和科學技術的不斷進步，實驗室診斷技包括細菌學、血清免疫學和分子生物學三個方面有了很大的進展，綜述如下。

1 細菌學檢測方法

結核分枝桿菌的檢測是病原學診斷的可靠標準，并且可作為判斷結核病治療療效、結核活動的主要指標。傳統的涂片鏡檢法、改良羅氏培養法等檢測方法雖然設備簡單、費用低廉等優點，但往往有檢出率低，周期長等局限性［1］。在近十多年以來，針對結核分枝桿菌的特性，建立了一系列快速檢測系統。

1.1 Bactec檢測系統(包括460TBBactec、BACTEC MGIT 960TB、MB/BacTec)460TBBactec方法陽性率約為80%，比傳統的改良羅氏培養法(L-J法)明顯提高;檢測時間約9～14 d，明顯比 L-J法縮短［2］。但是因底物有放射性，易污染環境，且設備價格昂貴，不宜推廣。

BACTEC MGIT 960系統是集分枝桿菌快速生長培養、檢測及藥敏技術為一體的全自動分枝桿菌培養儀。Rishi等［3-5］的研究結果顯示，該方法較固體培養法L-J法縮短了診斷時間并提高了診斷的敏感性。MB/BacTec系統是和BACTECMGIT 960系統相同，是應用液體培養的系統，此系統對標本中結核分枝桿菌復合群進行分離，和BACTEC-460系統相比，在肉眼下可看到結核桿菌生長，初分離率明顯提高，并且無放射污染，但是缺點是不能作菌型鑒定［6，7］。

1.2 噬菌體擴增法和噬菌體生物發光檢測 菌體擴增法是近年來新出現的用于檢測結核分枝桿菌中活菌的快速診斷方法，原理是:噬菌體在適宜條件下侵入標本中活的結核桿菌體內，在菌體內進行增殖，游離的噬菌體以噬菌體殺滅劑殺死，此時加入快生長分枝桿菌，此時侵入細菌體內的噬菌體大量繁殖，釋放出來，使結核桿菌指示細胞被感染、破壞、裂解，在電泳瓊脂版會出現噬菌斑。正常情況下，被加入噬菌體滅活劑后，因無噬菌體破壞指示細胞，使指示細胞在瓊脂版上均勻生長。據噬菌斑出現情況，判斷有無活菌生長，該方法靈敏度高，且不需要高致病菌的結核分枝桿菌和特殊設備，可用于快速檢測活的結核桿菌。賀瑜［8］應用此方法檢測結核分枝桿菌進行流行病學調查，趙慶華等［9］采用噬菌體法和涂片法比較觀察269例住院肺結核患者療效，噬菌體法檢測結核分枝桿菌陽性57例，陰性212例;涂片法陽性60例，陰性209例。并且彌補了涂片法不能檢測死菌活菌的不足。

噬菌體生物發光法檢測原理:在分枝桿菌噬菌體中插入蟲熒光素酶的基因Efflux重組噬菌體，在大量噬菌體在標本中獲得結核分枝桿菌內繁殖時，因重組的噬菌體內的蟲熒光素酶在體外與沖熒光素混合后，二者作用而發出熒光，發光強度以熒光素沒含量成正比，檢測發光強度經幸噬菌體的定性定量分析，再以噬菌體量測定結核分支桿菌含量。此方法較直觀，但是必須使用標準化培養基和發光儀，并要求與常規檢測的最低抑菌濃度值一致。熊瑜等［10］收集89份糖尿病合并結核感染患者的痰、支氣管鏡鏡抽取液標，應用噬菌體生物擴增法檢測結核分支桿菌，同時作抗酸染色、并用VersaTREKTM細菌培養儀做分支桿菌培養。噬菌體生物擴增法和/或培養陽性的菌株32株做分支桿菌菌種鑒定。噬菌體生物擴增法檢測結核分支桿菌快速、特異、敏感，在糖尿病合并結核感染的快速診斷中有重要價值。

2 血清免疫學檢測方法

研究表明，結核病患者體液免疫反應中特異性抗體水平明顯升高，因此可通過檢測患者血清中特異性抗體，鑒別疾病是否處于活動期，但是結核病中抗原多且復雜，因個體的免疫背景和疾病發展不同而異，可出現不同的抗體圖譜。

2.1 酶聯免疫吸附法(ELISA)LISA原理:在加入抗原或抗體吸附致固體的載體模板上，使標本與酶結合物反應，利用酶催化反應產生底物的呈色，檢測抗體或抗原的方法。ELISA法檢測是應用血清免疫學檢測患者患肺外結核的重要方法之一，在結核病血清學診斷方面研究最多、應用最廣［11，12］。但總的來說其方法還不夠成熟，檢測使用的抗原不同(菌種不同、純化程度不同、抗原成分不同)、觀察對象、病程不同，導致其結果差異很大，敏感性及特異性尚不夠穩定。Kashyap等［13］采用間接ELISA方法，應用Ag85復合物的單克隆抗體檢測血清標本中該抗原。陽幼榮等［14］應用ELISA方法測定結核分枝桿菌重組Mtb81蛋白抗原，提高了其免疫學檢測的敏感性和特異性。

2.2 T-SPOT-TB試驗 以特異性抗原為刺激源，應用酶聯免疫斑點技術診斷結核感染的新方法。項杰等［15］據結核感染后體內存在抗原特異性的記憶性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，迅速活化增值，釋放干擾素的原理，建立了以RDI編碼的結核特異性抗原6kD早期分泌靶向抗原(ES-AT-6)和10Kd培養濾過蛋白肽段庫為刺激源，檢測外周血中釋放結核特異性干擾素的T細胞，據此診斷結核感染。優點是實驗結果清晰，易判斷，綜合敏感性較高，在免疫低下人群中、肺外結核的診斷中能維持較高敏感性［16］。另 TSPOT-TB能夠準確鎖定需預防性抗結核治療的感染者，斑點越多發生活動性結核的可能性越大，短期內半點明顯增多，提示體內結核活動［17］，因此對于預防性治療十分必要。

2.3 結明(Myco DotTM)實驗 結明(Myco DotTM)實驗即結明三項(18KDa、16 KDa、LAM)，是國內外使用較早、較普遍的結核抗體快速檢測方法。最早僅檢測LAM，以后發展為三項。原理:把含有抗原的電泳梳放入被檢測的血清中，如標本中含有抗體，則抗原抗體結合，在把已結合抗原抗體的電泳梳，置于顯色液中，梳上附著抗原的部位就會出現紅色斑點，即為陽性。結核桿菌細胞壁上含有阿拉伯甘露糖，當有結核病活動時，會呈現陽性紅斑，而既往曾患結核病者或卡介苗接種后、健康人不會出現紅斑，但是因試劑為進口試劑價格昂貴，難廣泛開展。

2.4 γ-干擾素釋放試驗 受檢者全血或外周血中單核細胞(PBMC)，在特異或非特異抗原在體外刺激下，T淋巴細胞產生大量IFN-γ，用酶聯免疫斑點技術或酶聯免疫吸附法檢測IFN-γ血中的濃度或應用計數分泌IFN-γ細胞的方法。目前該方法已經在日本、英國、美國等地用于潛伏期肺結核和活動性肺結核感染者的診斷［18］。目前在臨床上不能準確判斷卡介苗接種TST陽性結果，或TST陰性臨床結合病史影像學檢查不能排除結核病存在時，γ-干擾素釋放試驗可作為一項重要的輔助診斷檢查，但是價格昂貴，基層不易開展。

3 分子生物學檢測方法

3.1 聚合酶鏈反應(PCR)技術 近二十年來，已經有很多種PCR技術用于檢測結核分枝桿菌插入序列［19，20］。Elbir等［21］報道了一種簡單、快捷并且敏感的PCR序列，行PCR檢測前不需做DNA純化，直接把PCR反應的混合物直接加入乙醇，應用IS6110插入序列，檢測了44種標本，全部陽性，簡化了試驗步驟，降低操作難度，敏感度特異性較高，是一種簡便快捷的基因檢測技術。尤其對于菌量少，有變異的易被常規細菌學檢測方法漏診的病人，進行早期診斷、鑒別診斷，觀察治療療效，有重要臨床價值。PCR技術不足之處是易受外界同源DNA污染，非特異性擴增出現假陽性結果，而由于細胞壁破環不徹底，或PCR抑制物存在，致出現假陰性結果，因此應用PCR檢測應結合臨床癥狀及其他輔助檢查，綜合分析以便明確診斷。

3.2 巢式 PCR技術 與普通PCR技術比較，巢式PCR技術有進一步發展，應用兩對引物擴增完整的DNA序列，一對為PCR的引物，另一對為巢式引物。原理是第二對引物結合于第一對引物的內部，使第二次擴增的產物較短，從而使擴增結果特異性更強。相對來說液體標本巢式PCR檢測率更高，特異性更強，普通PCR和巢式PCR兩種檢測方法發現巢式技術靈敏度、特異度較高。比較巢式PCR與抗酸染色兩種方法對可疑結核的固體石蠟組織檢測，發現此方法可提高檢出率。Schulz等［22］對190例中119例分枝桿菌DNA檢測陽性，其中71例符合典型結核桿菌;41例發現不典型分枝桿菌DNA。Azov等［23］應用此方法檢測46例石蠟切片，對于抗酸染色法明確診斷的結核病例，靈敏度100%，尤其對結核桿菌復合群和鳥型分枝桿菌有特異性。對于不典型的肉芽腫性病例，該方法明確診斷9例，其中4例符合不典型結核桿菌。由此說明巢式PCR對于石蠟組織的結核桿菌檢測有重要意義。

3.3 實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術 實時熒光定量，同時具有引物和探針的兩種特異性，對于細菌學檢測的特異性有明顯提高，自動完成Southern印記雜交，可提高基因的特異性。Pinsky等［24］介紹應用多重實時熒光定量PCR方法鑒定牛分枝桿菌、人型結核分枝桿菌及卡介苗。檢測60例標本中，57例為人型結核分枝桿菌和牛型結核分枝桿菌，3例為卡介苗接種。Chang等［25］實時熒光定量PCR方法進行了人型結核桿菌和牛型結核桿菌鑒定。Takahashi等［26，27］對此方法和巢式技術進行比較，該方法吸收了巢式技術的優點，避免了巢式PCR技術易受污染的缺點。盡管Real-Time PCR技術在結核分枝桿菌檢測方面有許多優勢，但由于其高靈敏性、實驗操作易受污染等而容易出現假陽性。但是實時熒光定量方法易出現假陽性結果，不能僅此方法作為診斷依據，只有具有一定數量時才有臨床意義。

3.4 限制性片段長度多態性PCR檢測技術 PCRRFLP是在PCR技術的基礎上，限制性內切酶聯合鑒定技術綜合分析，鑒定分枝桿菌菌種的可靠方法。因此較常規方法更準確、快速。Agacayak等［28］通應用限制性內切酶技術檢測65kD蛋白基因的PCR產物進行分析，發現能夠檢測出結核分枝桿菌屬種。Caws等［29］利用該技術進行了耐異煙肼的結核菌中含KatG-315突變體。此突變體可保護結核菌不被異煙肼殺滅，使結核菌毒力增強，應用此方法可檢出耐藥菌，提高藥敏試驗敏感性。Yzquierdo等［30］應用PCR方法循環擴增Hsp65基因片段，再用RFLP消化此基因片段，檢測是否存在結核桿菌感染。該檢測方法檢測的關鍵在于內切酶和引物的選擇［31］。

3.5 基因芯片技術(Gene Chips) 基因芯片是，以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術將三種抗原18 kDa、16 kDa、LAM固定于同一膜片上，利用微孔濾膜的滲透、濃集作用，抗原抗體在固相膜上快速反應，生成免疫復合物，用免疫金作標記，待膜顯色，把顯色的芯片進行不通抗原點陣灰度值分析，檢測出結核分枝桿菌。應用高密度寡核苷酸序列通過利用rpoB基因的保守片段與探針基因芯片雜交，進行了耐利福平突變基因rpoB的檢測。第一塊結核病的基因芯片，包括2部分，其中一部分用于耐利福平菌株中rpoB基因的檢測，部分是在結核分枝桿菌有種間多態性的16SrRNA基因片段，可鑒別結核分支和非分枝桿菌。基因芯片檢測法最大的優勢在于能夠同時分析成千上萬個基因。進一步利用DNA芯片分別檢測耐異煙肼菌株和耐利福平菌株，敏感度分別為95%和80%。段慧萍等［32］應用結核蛋白芯片檢測 18 kDa、16 kDa、LAM 三種結核抗體，三種抗體聯合檢測對于結核菌感染血清學診斷有很高靈敏度和特異性結果有芯片閱讀儀完成，避免認為主觀誤差的優點。基因芯片在結核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性監測、基因組比較分析等方面發揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高等因素，限制了其在基層單位的應用。

綜上所述，近年來結核病的實驗室診斷在多方面有了很大的進展，但由于結核桿菌變異較大，且具有多樣性，同時由于應用抗結核藥物的不規范性，不能足量足療程正規治療，出現多種耐藥菌，耐多藥菌株，單一方法往往不能鑒定出所有結核桿菌，需多種方法聯合。多種實驗診斷技術由實驗室向臨床應用的過度，但仍存在很多問題，比如許多實驗試劑設備價格昂貴，操作復雜不易在基層推廣使用。但是分子生物學技術隨著基因診斷發展，對結核桿菌遺傳信息的不斷發展，為快速診斷結核分枝桿菌提供了更快捷、更敏感的手段，在診斷技術領域擁有巨大的潛力，隨著技術的發展，結核病的診斷也將不斷完善和發展。

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