人參皂苷含量變化及其影響因素

盧 聰 鮑勇剛 石松傳 William Jia 劉新民

(1中國醫學科學院藥用植物研究所，北京，100193;2北京博肽健諾威生物技術有限公司，北京，100085;3加拿大UBC大學，加拿大)

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)是我國名貴中藥材，為五加科人參屬植物，陰生且生長緩慢，對生長環境要求較高。皂苷是人參主要的活性物質，研究表明，人參皂苷具有廣泛的生理活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抑制細胞凋亡等[1]。因此人參皂苷含量被認為是衡量人參內在質量的重要指標之一。而人參皂苷的含量因品種、部位、生長條件、采集時間以及炮制方法等不同而存在統計學意義;近年來，隨著現代生物技術尤其是組學技術在人參研究中的廣泛深入應用，人參皂苷合成相關的基因與蛋白組學的研究逐漸深入到人參研究中，而人參皂苷含量也與此類基因及蛋白表達的變化息息相關。本文從不同生長環境、皂苷合成相關基因及差異表達蛋白這三方面對人參皂苷含量變化的影響因素進行歸納整理，以期對人參皂苷含量相關研究提供有益的幫助。

1 人參皂苷及其含量變化

人參皂苷由糖的半縮醛羥基與非糖組分構成，屬于三萜類化合物，其中非糖部分稱為苷元。根據苷元化學結構的不同，人參皂苷分為兩大類型，即達瑪烷型和齊墩果烷型。達瑪烷型為四環三萜類皂苷，齊墩果烷型為五環三萜類皂苷。達瑪烷型人參皂苷依據糖基在碳骨架上的位置不同(C－3，C－6及C－20)被分為原人參二醇型(Protopanaxadiols，PPD)和原人參三醇(Protopanaxatriols，PPT)。二醇型達瑪烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3和/或C－20位，包括Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg3，Rh2，Rh3;三醇型達瑪烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3、C－6和/或C－20位，包括 Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。

1854年，Garriques等在進行西洋參化學成分研究時，最早分離出了含有皂苷成分的組分[2]。但直到1963年，日本學者Shibata才從人參根中分離鑒定出皂苷及其結構[3－4]，這些皂苷被稱為人參皂苷。這之后，研究者們不斷從人參根、莖、葉、花蕾、果實及種子中分離鑒定出各種皂苷成分，目前已經確認人參總皂苷是由100多種人參皂苷組成，其中已被分離并鑒定結構的皂苷達60 多種[1]。

不同的人參其皂苷含量是有差別的。何紹玉等[5]通過對林下山參和園參中人參皂苷含量的分析比較證實人參總皂苷的含量林下山參高于園參。荊淑芹等[6]采用高效液相色譜法對園參、林下參、紅參三種人參的皂苷含量進行測定，發現園參與紅參在皂苷Rg1、Re、Rb2含量上是有差異的，林下參中皂苷單體Re含量高于園參中，而林下參與紅參在皂苷Rb2、Rf、Re以及皂苷總量上也是有差異的。趙亞會等[7]對淺橙果人參、深橙果人參、橙果人參、紅果人參、黃果人參、大馬牙類型人參、二馬牙類型人參、圓膀圓蘆類型、吉參一號以及長脖類型人參進行含量測定與分析，結果顯示:在不同果實顏色的人參類型中，以純色系類型紅果和黃果人參的單體皂苷含量總和較高，且它們的單體皂苷Rg1含量也呈相同趨勢。在以根部形態為分類特征的人參類型中，大馬牙型人參中的Rg1含量最高。而人參不同部位的皂苷含量也有差異。Shi等[8]對5年生人參根、葉、根毛、根莖、莖的總皂苷和單體皂苷的量進行了比較，結果顯示:總皂苷含量(mg/g)最高的是根毛(85.90)，最低的是莖(9.79)，僅次于根毛的是葉(69.85)、根莖(38.33)和根(36.41)。人參皂苷Re在人參葉和根毛中的量是人參皂苷Rg1在其中的5倍，但是在人參根中則低于人參皂苷Rg1;人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd在人參根毛中的量最高，在人參莖中沒有檢測到Rb3和Rc。而李闖等[9]進行了更多不同人參部位皂苷含量的研究，結果顯示:人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd在人參須根和支根中含量比其他部位均高;皂苷Rg1在葉和果肉中含量顯著;此外Re在人參葉和果肉中含量均很高，約占總皂苷含量的50%。這兩位的研究結果相類似，均提示研究者們除了人參根能得到完全利用外，人參的其他部位如葉和果肉亦含有豐富的皂苷成分，極具價值潛質，引導人們進行更加深入的人參不同部位皂苷成分和含量的研究工作。

2 不同生長環境對人參皂苷含量的影響

人參皂苷含量受多種因素影響，而由于諸如莖葉數、生育期、生長年限、土壤、施肥、光照、栽培方式、采收期等的不同，都使得不同產地的人參中總皂苷及單體皂苷的含量具有顯著的差異[10]。張燕娣等[11]通過研究不同莖葉數人參在不同生育期的人參皂苷含量變化，發現單體皂苷和總皂苷的結果基本一致，從總皂苷和單體皂苷的結果看出人參皂苷含量:雙莖葉＞三莖葉＞單莖葉即人參中皂苷含量隨光合葉面積的變化而變化，而且在紅果期的末期含量最高。Lee等[12]分析了4年生人參葉在受光率為5%、10%、20%、30%時人參根總皂苷量的差異，發現總皂苷量隨受光率的增大而增加，而在30%受光率時略降低。Kim等[13]分析比較了光量子分別為 19、39、26、35 μmol/(s·m2)的藍色、紅色、1∶1藍紅混合光LED及熒光燈對2年生人參總皂苷量的影響，結果得出:總皂苷量(mg/g)由高到低的順序為藍色LED(46.1)＞熒光燈(45.3)＞1∶1藍紅混合光LED(40.2)＞紅色LED(40.1)，但各種光源間無統計學意義。張蘭蘭等[14]通過分析不同年份(5～17年)林下山參葉中多個皂苷類成分的含量，考察年份對皂苷含量的影響，并與已有的研究報道作比較發現:5～17年林下山參葉皂苷成分隨著生長年份增長大體上存在降低－升高－降低的變化過程，其中14年林下山參葉中的皂苷類成分含量最高，其各皂苷類成分含量均處于較高水平，尤其是人參皂苷Re和人參皂苷Rd，顯著高于其他年份林下山參葉且其總皂苷成分含量最高。而同一批5～17年林下山參根部的皂苷類成分研究表明，5～10年根部皂苷類成分升高，隨后降低，14年生林下山參總皂苷含量最低，16、17年生林下山參總皂苷含量又開始升高，與葉中的變化趨勢相反。An等[15]對4月18日、5月15日、6月18日、8月18日、9月18日、10月18日采收的4年生人參的總皂苷和單體皂苷量進行了比較，結果顯示:總皂苷量分別為 2.52%、4.09%、1.92%、2.14%、1.82%、1.75%，總皂苷量在5月15日最多，之后隨采收期的延長而逐漸減少，且各采收期間具有顯著差異;人參皂苷Re等7種單體皂苷量的變化趨勢與總皂苷量的變化趨勢相似，也在5月15日最多。孫海等[16]研究證實土壤養分影響人參皂苷的積累，其中土壤中有機質和全量氮、磷直接影響人參總皂苷的積累。土壤有機質是其他養分的來源，是微生物生存和繁衍的碳源和氮源，直接影響著土壤中速效養分的供給，而速效養分是人參完成正常生理代謝和進行次生代謝所必須的物質基礎;氮和磷的含量則直接影響人參的次生代謝途徑，影響人參皂苷的合成。Li等[17]對直播栽培與移植栽培5年生人參的總皂苷及單體皂苷量進行了比較，結果得出直播參的主根及支根的總皂苷量為23.8 mg/g、40.9 mg/g，高于移植參的 22.2 mg/g、35.7 mg/g，而須根則為移植參總皂苷量83.1 mg/g高于直播參78.8 mg/g，結合干物質量計算出的直播參與移植參的皂苷量分別為 722.1 mg、1142.9 mg;單體皂苷 Rb2、Rb3、Rf與測試的3個部位無關，直播參均高于移植參，而Rd和Rh1則相反，直播參均低于移植參。據此為了綜合利用寶貴的人參資源，擴大人參具有藥用價值的部位，合理進行人工種植和炮制等提供一定的參考，從多方位多因素進行更深入的皂苷含量的研究是十分必要的。

3 皂苷合成相關基因對人參皂苷含量的影響

根據國內外學者的研究，人參皂苷的生物合成步驟是在許多關鍵酶的共同作用下完成的，這些酶包括3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合成酶(SS)、鯊烯環氧酶(SE)、氧化鯊烯環化酶(OSCS)、β－香樹素合成酶(β－AS)、達瑪烷二醇合成酶(DS)、細胞色素 P450(CYP450)以及糖基轉移酶(GT)。研究者們對人參皂苷合成中關鍵酶的基因進行分析研究發現，不同關鍵酶基因的變化與皂苷含量變化的相關性極高。蔣世翠等[18]在分析了4年生西洋參不同組織器官中總皂苷和單體皂苷量的差異及其與人參皂苷合成途徑中鯊烯合成酶(SQS)和鯊烯環氧酶(SQE)基因表達量之間的關系;這些組織器官分別是:須根、側根、根皮(周皮和韌皮部)、根心(木質部)、蘆頭、莖、小葉柄、大葉柄、葉片、果莖、果柄、果肉、種皮、種仁。結果表明 SQS和SQE基因在14個組織器官中的表達量具有非常顯著的差異(P＜0.01)并與人參皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rd和總皂苷量之間有顯著的正相關關系(P＜0.05)。

此外，提高或降低人參皂苷合成關鍵限速酶基因的表達，會極大影響人參中的皂苷含量。Lee等[19]將克隆分離出的鯊烯合成酶基因(PgSS1，AB115496)導入人參不定根中過量表達，發現七種人參皂苷(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1)含量與未轉基因植株相比均有所增加，人參總皂苷量是對照的3倍。Han等[20]利用RNAi技術研究了SQE基因在人參皂苷合成中的作用，通過HPLC檢測發現SQE基因沉默后，人參總皂苷量降低了84.5%。Kim等[21]將人參的PgFPS轉到積雪草毛狀根中使其過量表達，發現積雪草達瑪烷合酶的mRNA水平顯著提高，三萜皂苷羥基積雪草苷和積雪草苷的產量瞬時升高。Han等[22]對茉莉酸甲酯誘導的人參不定根進行了轉錄組測序，得到9個候選CYP450全長基因。其中CYP716A47基因不僅可使得茉莉酸甲酯誘導表達量上調，而且轉入過量表達SS基因的轉基因人參植株后能使人參根中皂苷的產量提高。除上述相關研究外，3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)基因相關的轉基因及基因敲除等研究未見相關報道，而近年來雖有關于糖基轉移酶基因克隆的報道[23]，但迄今尚未有從人參屬植物中克隆到GT基因及相關轉基因等研究的報道。

4 人參中差異表達蛋白對皂苷含量的影響

隨著蛋白質組學技術的不斷成熟及廣泛應用，除了皂苷代謝相關的酶類變化所導致的皂苷含量變化外，研究者們期望利用蛋白質組學技術鑒定其他與皂苷變化相關的差異表達蛋白。早期的人參蛋白組學分析多是對培養的人參須根進行，因為培養的人參須根作為研究材料有無法替代的優勢。Kim等[24]使用2－DE技術從培養的人參須根中共分離出280個蛋白點，推測出其中159個蛋白的功能，最終確證91個。在這些確證功能的蛋白中，超過20%的蛋白參與能量代謝與應激反應，但是沒有發現參與次級代謝產物生成的酶類。Lum等[25]同樣用雙向電泳技術，比較了人參四個不同部位主根、須根、蘆頭及參皮的蛋白差異，雖然沒有特別突出的蛋白差異點出現，但是電泳圖上相同蛋白點的排列模式卻有顯著差別。孫立偉等[26]分析園參蘆頭、主根、須根、表皮等4個不同部位的雙向電泳圖譜，發現了人參不同部位13個相同的蛋白點，并在主根中發現了2個特異點，在蘆頭和表皮中發現了1個特異點，在須根中發現了1組特異點群 (3個點)。Nam等[27]比較了在不同光照環境下，人參葉片的蛋白表達差異，鑒定出的蛋白點功能多與能量代謝、蛋白質穩定以及氧化應激保護等相關。Kim等[28]比較了培養的人參須根以及野生人參根中的蛋白差異，雖然有超過了90個共同的蛋白點，但是野生人參根中的表達蛋白依舊與培養的人參根須有很大的差異。而使用蛋白組學技術分析不同品種人參后，不同人參樣品的2－DE電泳圖間有明顯的差別，能夠用于不同人參品種的鑒別[29]。最近，Nagappan等[30]用2－DE技術比較分析了人參與印度參根中差異表達的蛋白，從電泳中分別挑出21個高麗參蛋白及35個印度參蛋白的序列進行質譜鑒定，并分別對其中14個和22個高麗參及印度參的蛋白功能進行確定，發現這些蛋白主要參與細胞代謝，防御以及次級代謝，但是共同參與睡茄內酯和人參皂苷生物合成的蛋白卻沒有發現。上述研究表明，雖然皂苷合成在人參生理代謝過程中屬于次級代謝反應，但是其他人參生理代謝相關蛋白的變化對皂苷合成的可能影響不應忽略。遺憾的是，即便不同環境下的人參中誘導表達的蛋白是顯著不同的，但未鑒定出與人參皂苷合成直接相關的差異表達蛋白。

5 展望

人參皂苷產量低、活性高，為滿足日益增長的產業化需求，因此人參皂苷含量變化的研究也不斷向縱深發展。現代生物技術的應用尤其是以基因組及蛋白質組學技術為代表的組學技術的廣泛應用，使得人參皂苷含量變化相關的研究取得了很大的進展但也存在著一些問題，如不同生境下人參皂苷含量變化的機理研究尚需深入;缺乏有效的人參組培體系從而限制人參轉基因研究的開展，人參基因組數據庫的缺乏成為制約發現、鑒定差異表達蛋白的主要因素等。相信隨著人參基因組測序工作的展開，以及代謝組、轉錄組等新技術的廣泛深入應用，人參皂苷含量變化相關的研究工作將進入更加全面的發展時期，也必將對人參產業的發展帶來深遠影響。

[1]Lu JM，Yao QZ，Chen QY.Ginseng Compounds:An Update on Their Molecular Mechanisms and Medical Applications[J].Curr Vasc Pharmacol，2009，7(3):293 –302.

[2]Garriques SS.On panaquilon，a new vegetable substance[J].Ann Chem Pharm，1854，90:231－234.

[3]Shibata S，Ando T，Tanaka O，et al.Saponins and sapogenins of Panax ginseng C.A.Meyer and some other Panax spp[J].Yakugaku Zasshi，1965，85:753－755.

[4]Shibata S，Tanaka O，Soma K，et al.Studies on saponins and sapogenins of ginseng[J].The structure of panaxatriol.Tetrahedron Lett，1965，42:207－213.

[5]何紹玉，李偉，鄭毅男，等.林下山參與園參中腺苷和人參皂苷含量比較分析[J].藥物分析雜志，2010，30(9):1701－1706.

[6]荊淑芹，姜海平，劉鳳云.生曬參、紅參、林下參中7種人參皂苷含量的比較[J].中華中醫藥學刊，2009，27(1):207－209.

[7]趙亞會，司方方，吳連舉，等.人參、西洋參部分種質資源的單體人參皂苷測定分析[J].特產研究，2006，28(2):67－70.

[8]Shi W，Wang YT，Li J，et al.Investigation of ginsenosides in different parts and ages of Panax ginseng[J].Food Chem，2007，102:664－668.

[9]李闖，王義，張美萍，等.人參不同部位皂苷成分的HPLC測定[J].吉林中醫藥，2010，30(4):347－349.

[10]李翔國，全炳武，李虎林，等.人參皂苷量變異的研究進展[J].中草藥，2012，43(11):2300－2304.

[11]張燕娣，吳俊，李哲，等.不同生育期光合葉面積對人參皂苷含量的影響[J].中國農學通報，2012，28(19):233－239.

[12]Lee JC，Choi JH，Cheon SK，et al.Studies on the optimum light intensity for growth of Panax ginseng II.Effect of light intensity on the contents of saponin and free sugar in the ginseng leaf[J].Korean J Crop Sci，1983，28(4):497－503.

[13]Kim MJ，Li XG，Han JS，et al.Effect of blue and red LED irradiation on growth characteristics and saponin contents in Panax ginseng C.A.Meyer[J].Korean J Med Crop Sci，2009，17(3):187－191.

[14]張蘭蘭，高文遠，宋兆輝，等.不同年份林下山參葉中皂苷類成分含量變化研究[J].中國中藥雜志，2012，37(17):2530－2533.

[15]An YN，Lee SY，Choung MG，et al.Ginsenoside concentration and chemical component as affected by harvesting time of four－year ginseng root[J].Korean J Crop Sci，2002，47(3):216－ 220.

[16]孫海，張亞玉，孫長偉，等.不同生長模式下人參土壤養分狀況與人參皂苷含量的關系[J].西北農業學報，2012，21(8):146－152.

[17]Li XG，Kan SJ ，Han J S，et al.Comparison of growth increment and ginsenoside content in different parts of ginseng cultivated by direct seeding and transplanting[J].Korean J Med Crop Sci，2010，18(2):70－73.

[18]蔣世翠，劉偉燦，王義，等.西洋參不同器官中皂苷量與鯊烯合成酶和鯊烯環氧酶基因表達的相關性[J].中草藥，2011，42(3):579－584.

[19]Lee MH，Jeong JH，Seo JW，et al.Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene[J].Plant Cell Physiology，2004，45(8):976 ～984.

[20]Han JY，In JG，Kwon YS，et al.Regulation of ginsenoside and phytostero biosynthesis by RNA interferences of squalene epoxidase gene in Panax ginseng[J].Phytochemistry，2010，71:36－46.

[21]Kim OT，Kim SH，Ohyama K，et al.Upregulation of phytosterol and triterpene biosynthesis in Centella asiatica hairy roots overexpressed ginseng farnesyl diphosphate synthase[J].Plant Cell Rep，2010，29:403－ 411.

[22]Han JY，Kim HJ，Kwon YS，et al.The Cyt P450 enzyme CYP716A47 catalyzes the formation of protopanaxadiol from dammarenediol－II during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng[J].Plant Cell Physiol，2011，52:2062－2073.

[23]Chen X，Xue Y，Liu JH，et al.Purification and characterization of glucosyltransferase from Panax Ginseng hairy root cultures[J].Pharm Biotechnol，2009，16:50－54.

[24]S.I.Kim，J.Y.Kim，E.A.Kim，et al.Proteome analysis of hairy root from Panax ginseng C.A.Meyer using peptide fingerprinting，internal sequencing and expressed sequence tag data[J].Proteomics，2003，3:2379－2392.

[25]John Hon－ Kei，Lum，Ka－ Lee，Fung，Pik－ Yuen ，et al.Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C.A.Meyer and the potential to use it as an identification tool[J].Proteomics，2002，2:1123 – 1130.

[26]孫立偉，馬朋濤，麻銳，等.園參根不同部位雙向電泳圖譜的比較分析[J].華中師范大學學報:自然科學版，2010，44(4):639－643.

[27]Myung HN，Eun JH，Jin YK，et al.Proteome analysis of the responses of Panax ginseng C.A.Meyer leaves to high light:Use of electrospray ionization quadrupole－time of flight mass spectrometry and expressed sequence tag data[J].Proteomics，2003，3:2351 – 2367.

[28]S.I.Kim，S.M.Kweon，E.A.Kim，J.Y.Kim，S.Kim，J.S.Yoo，Y.M.Park[J].Plant Physiol，2004，161:837.

[29]John Lum，Ka－ Lee Fung，Pik－ Yuen Cheung，et al.Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C.A.Meyer and the potential to use it as an identification tool[J].Proteomics，2002，2:1123 – 1130.

[30]Nagappan A，Karunanithi N，Sentrayaperumal S，etal.Comparative root protein profiles of Korean ginseng(Panax ginseng)and Indian ginseng(Withania somnifera)[J].Am J Chin Med，2012，40(1):203－218.