RP—HPLC法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質

趙亮　徐炳欣　石曉曉　蘭丙欣

【摘要】 目的 建立高效液相色譜法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質的方法。方法 應用HPLC法， 色譜柱為Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長為227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。結果 紫杉醇濃度在10～125 mg·L-1的范圍內， 溶液的濃度與色譜峰面積線性關系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度試驗RSD為0.17%（n=5）， 平均加樣回收率為99.33%， RSD=0.38%。結論 本方法簡便、準確、快速、重復性好， 可用于紫杉醇注射液的含量測定和有關物質檢查。

【關鍵詞】 紫杉醇注射液；高效液相色譜法；含量測定；有關物質

紫杉醇（paclitaxel）是從短葉紫杉樹皮中提取的具有抗癌活性物質， 為一種新型的抗微管藥物[1]。紫杉醇的作用機制為：促進微管雙聚體裝配成微管， 并通過干擾去多聚化過程而使微管的穩定， 從而抑制微管網正常動力學重組， 導致細胞分裂受阻。此外， 本藥還具有放射增敏效應， 可促進離子照射所致細胞損害[2， 3]。臨床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等癌癥的治療[4， 5]。藥物含量是評價藥品質量的重要指標之一， 為保證紫杉醇注射液的質量， 實現臨床用藥安全可靠， 作者嘗試建立高效液相色譜法（HPLC）測定其含量。該方法準確， 重復性好， 專屬性強， 與中國藥典2010年版收錄的紫杉醇含量測定方法相比較， 具有簡便、快速的優點。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；島津SPD-15C Essentia uv/vis檢測器；島津工作站LC-solution；AR 1140 型電子天平（梅特勒·托利多儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW 120D 型電子天平（日本島津公司）。

紫杉醇對照品（許昌恒生藥業有限公司提供， 純度>99.9%， 批號為A0177）；紫杉醇注射液（購于江蘇紅豆衫藥業有限公司， 規格5 ml/30 mg， 批號分別為20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；乙腈（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；其它試劑均為分析純， 水為超純水。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 對照品溶液的配制 精密稱取紫杉醇對照品適量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得濃度為500 mg·L-1對照品貯備液。

2. 3 樣品溶液的制備 分別取批號為20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液適量， （相當于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻即得。

2. 4 專屬性試驗 紫杉醇對照品（A）和樣品中紫杉醇的HPLC圖（B）， 見圖1。

圖1 對照品（A）及樣品（B）

2. 5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分別置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得到對照品濃度分別為10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；進樣， 記錄峰面積值。以對照品濃度（X）為橫坐標， 對照品峰面積（Y）為縱坐標， 進行線性回歸， 得回歸方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1時線性關系良好。

2. 6 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液， 按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次， 其峰面積的RSD為0.17%（n=5）。

2. 7 穩定性試驗 取“2.3”項下樣品溶液（批號：20130805）在室溫避光下放置， 分別于0、2、4、6、8、12 h時， 在儀器不關閉狀態下測定不同時間內的含量。結果， 樣品含量的RSD為0.26%（n=6）， 表明樣品溶液在12 h內穩定性好。

2. 8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量批號為20130805的紫杉醇注射液適量（相當于紫杉醇3 mg）， 分別精密加入紫杉醇對照品適量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表1。

2. 9 樣品含量測定 將3批樣品溶液分別按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表2。

2. 10 有關物質檢查 采用不加校正因子的主成分自身對照法。精密稱取紫杉醇適量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 制成200 mg·L-1的溶液作為供試品溶液；取供試品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流動相稀釋至刻度， 作為對照溶液。取對照溶液20 μl進樣， 調節檢測靈敏度， 使主峰高達到記錄儀滿量程的10%左右， 再取供試品溶液進樣20 μl， 記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。扣除溶劑峰和輔料峰， 量取色譜圖上紫杉醇色譜峰外各雜質的峰面積總和， 并與對照溶液主成分的峰面積比較， 計算雜質含量。結果見表2， 3批樣品中有關物質均<1.2%。

3 討論

應用紫外分光光度計對紫杉醇在190～400 nm范圍內掃描， 結果顯示紫杉醇在227 nm處有較強吸收。作者采用227 nm作為該分析方法的檢測波長， 可獲得較高靈敏度， 基線平穩， 良好的峰形。

為了得到一個良好的分析效果， 作者在試驗中對流動相進行了優化。試驗分別考察了甲醇-水系統、乙腈-水系統、甲醇-乙腈-水系統， 結果發現以甲醇-乙腈-水系統為流動相， 在選定的檢測波長條件下， 基線穩定， 能夠得到良好的峰形， 最終確定流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）為該分析方法的流動相。總之， 本方法操作簡便、準確度高、重現性好， 可用于紫杉醇含量的測定與質量控制。

參考文獻

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 趙惠.紫杉醇周圍神經毒性臨床觀察.中國實用醫藥， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龔奎玉，王志東，李建璜.中國實用醫藥， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.

【摘要】 目的 建立高效液相色譜法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質的方法。方法 應用HPLC法， 色譜柱為Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長為227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。結果 紫杉醇濃度在10～125 mg·L-1的范圍內， 溶液的濃度與色譜峰面積線性關系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度試驗RSD為0.17%（n=5）， 平均加樣回收率為99.33%， RSD=0.38%。結論 本方法簡便、準確、快速、重復性好， 可用于紫杉醇注射液的含量測定和有關物質檢查。

【關鍵詞】 紫杉醇注射液；高效液相色譜法；含量測定；有關物質

紫杉醇（paclitaxel）是從短葉紫杉樹皮中提取的具有抗癌活性物質， 為一種新型的抗微管藥物[1]。紫杉醇的作用機制為：促進微管雙聚體裝配成微管， 并通過干擾去多聚化過程而使微管的穩定， 從而抑制微管網正常動力學重組， 導致細胞分裂受阻。此外， 本藥還具有放射增敏效應， 可促進離子照射所致細胞損害[2， 3]。臨床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等癌癥的治療[4， 5]。藥物含量是評價藥品質量的重要指標之一， 為保證紫杉醇注射液的質量， 實現臨床用藥安全可靠， 作者嘗試建立高效液相色譜法（HPLC）測定其含量。該方法準確， 重復性好， 專屬性強， 與中國藥典2010年版收錄的紫杉醇含量測定方法相比較， 具有簡便、快速的優點。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；島津SPD-15C Essentia uv/vis檢測器；島津工作站LC-solution；AR 1140 型電子天平（梅特勒·托利多儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW 120D 型電子天平（日本島津公司）。

紫杉醇對照品（許昌恒生藥業有限公司提供， 純度>99.9%， 批號為A0177）；紫杉醇注射液（購于江蘇紅豆衫藥業有限公司， 規格5 ml/30 mg， 批號分別為20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；乙腈（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；其它試劑均為分析純， 水為超純水。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 對照品溶液的配制 精密稱取紫杉醇對照品適量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得濃度為500 mg·L-1對照品貯備液。

2. 3 樣品溶液的制備 分別取批號為20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液適量， （相當于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻即得。

2. 4 專屬性試驗 紫杉醇對照品（A）和樣品中紫杉醇的HPLC圖（B）， 見圖1。

圖1 對照品（A）及樣品（B）

2. 5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分別置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得到對照品濃度分別為10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；進樣， 記錄峰面積值。以對照品濃度（X）為橫坐標， 對照品峰面積（Y）為縱坐標， 進行線性回歸， 得回歸方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1時線性關系良好。

2. 6 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液， 按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次， 其峰面積的RSD為0.17%（n=5）。

2. 7 穩定性試驗 取“2.3”項下樣品溶液（批號：20130805）在室溫避光下放置， 分別于0、2、4、6、8、12 h時， 在儀器不關閉狀態下測定不同時間內的含量。結果， 樣品含量的RSD為0.26%（n=6）， 表明樣品溶液在12 h內穩定性好。

2. 8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量批號為20130805的紫杉醇注射液適量（相當于紫杉醇3 mg）， 分別精密加入紫杉醇對照品適量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表1。

2. 9 樣品含量測定 將3批樣品溶液分別按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表2。

2. 10 有關物質檢查 采用不加校正因子的主成分自身對照法。精密稱取紫杉醇適量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 制成200 mg·L-1的溶液作為供試品溶液；取供試品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流動相稀釋至刻度， 作為對照溶液。取對照溶液20 μl進樣， 調節檢測靈敏度， 使主峰高達到記錄儀滿量程的10%左右， 再取供試品溶液進樣20 μl， 記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。扣除溶劑峰和輔料峰， 量取色譜圖上紫杉醇色譜峰外各雜質的峰面積總和， 并與對照溶液主成分的峰面積比較， 計算雜質含量。結果見表2， 3批樣品中有關物質均<1.2%。

3 討論

應用紫外分光光度計對紫杉醇在190～400 nm范圍內掃描， 結果顯示紫杉醇在227 nm處有較強吸收。作者采用227 nm作為該分析方法的檢測波長， 可獲得較高靈敏度， 基線平穩， 良好的峰形。

為了得到一個良好的分析效果， 作者在試驗中對流動相進行了優化。試驗分別考察了甲醇-水系統、乙腈-水系統、甲醇-乙腈-水系統， 結果發現以甲醇-乙腈-水系統為流動相， 在選定的檢測波長條件下， 基線穩定， 能夠得到良好的峰形， 最終確定流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）為該分析方法的流動相。總之， 本方法操作簡便、準確度高、重現性好， 可用于紫杉醇含量的測定與質量控制。

參考文獻

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 趙惠.紫杉醇周圍神經毒性臨床觀察.中國實用醫藥， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龔奎玉，王志東，李建璜.中國實用醫藥， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.

【摘要】 目的 建立高效液相色譜法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質的方法。方法 應用HPLC法， 色譜柱為Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長為227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。結果 紫杉醇濃度在10～125 mg·L-1的范圍內， 溶液的濃度與色譜峰面積線性關系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度試驗RSD為0.17%（n=5）， 平均加樣回收率為99.33%， RSD=0.38%。結論 本方法簡便、準確、快速、重復性好， 可用于紫杉醇注射液的含量測定和有關物質檢查。

【關鍵詞】 紫杉醇注射液；高效液相色譜法；含量測定；有關物質

紫杉醇（paclitaxel）是從短葉紫杉樹皮中提取的具有抗癌活性物質， 為一種新型的抗微管藥物[1]。紫杉醇的作用機制為：促進微管雙聚體裝配成微管， 并通過干擾去多聚化過程而使微管的穩定， 從而抑制微管網正常動力學重組， 導致細胞分裂受阻。此外， 本藥還具有放射增敏效應， 可促進離子照射所致細胞損害[2， 3]。臨床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等癌癥的治療[4， 5]。藥物含量是評價藥品質量的重要指標之一， 為保證紫杉醇注射液的質量， 實現臨床用藥安全可靠， 作者嘗試建立高效液相色譜法（HPLC）測定其含量。該方法準確， 重復性好， 專屬性強， 與中國藥典2010年版收錄的紫杉醇含量測定方法相比較， 具有簡便、快速的優點。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；島津SPD-15C Essentia uv/vis檢測器；島津工作站LC-solution；AR 1140 型電子天平（梅特勒·托利多儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW 120D 型電子天平（日本島津公司）。

紫杉醇對照品（許昌恒生藥業有限公司提供， 純度>99.9%， 批號為A0177）；紫杉醇注射液（購于江蘇紅豆衫藥業有限公司， 規格5 ml/30 mg， 批號分別為20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；乙腈（色譜純）（天津市四友精細化學品有限公司）；其它試劑均為分析純， 水為超純水。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 檢測波長227 nm， 柱溫35℃， 流速為1.0 ml/min， 進樣量為20 μl， 流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 對照品溶液的配制 精密稱取紫杉醇對照品適量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得濃度為500 mg·L-1對照品貯備液。

2. 3 樣品溶液的制備 分別取批號為20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液適量， （相當于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻即得。

2. 4 專屬性試驗 紫杉醇對照品（A）和樣品中紫杉醇的HPLC圖（B）， 見圖1。

圖1 對照品（A）及樣品（B）

2. 5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分別置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 得到對照品濃度分別為10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；進樣， 記錄峰面積值。以對照品濃度（X）為橫坐標， 對照品峰面積（Y）為縱坐標， 進行線性回歸， 得回歸方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1時線性關系良好。

2. 6 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液， 按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次， 其峰面積的RSD為0.17%（n=5）。

2. 7 穩定性試驗 取“2.3”項下樣品溶液（批號：20130805）在室溫避光下放置， 分別于0、2、4、6、8、12 h時， 在儀器不關閉狀態下測定不同時間內的含量。結果， 樣品含量的RSD為0.26%（n=6）， 表明樣品溶液在12 h內穩定性好。

2. 8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量批號為20130805的紫杉醇注射液適量（相當于紫杉醇3 mg）， 分別精密加入紫杉醇對照品適量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表1。

2. 9 樣品含量測定 將3批樣品溶液分別按“2.1”項下實驗條件進樣， 結果見表2。

2. 10 有關物質檢查 采用不加校正因子的主成分自身對照法。精密稱取紫杉醇適量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀釋并定容至刻度， 搖勻， 制成200 mg·L-1的溶液作為供試品溶液；取供試品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流動相稀釋至刻度， 作為對照溶液。取對照溶液20 μl進樣， 調節檢測靈敏度， 使主峰高達到記錄儀滿量程的10%左右， 再取供試品溶液進樣20 μl， 記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。扣除溶劑峰和輔料峰， 量取色譜圖上紫杉醇色譜峰外各雜質的峰面積總和， 并與對照溶液主成分的峰面積比較， 計算雜質含量。結果見表2， 3批樣品中有關物質均<1.2%。

3 討論

應用紫外分光光度計對紫杉醇在190～400 nm范圍內掃描， 結果顯示紫杉醇在227 nm處有較強吸收。作者采用227 nm作為該分析方法的檢測波長， 可獲得較高靈敏度， 基線平穩， 良好的峰形。

為了得到一個良好的分析效果， 作者在試驗中對流動相進行了優化。試驗分別考察了甲醇-水系統、乙腈-水系統、甲醇-乙腈-水系統， 結果發現以甲醇-乙腈-水系統為流動相， 在選定的檢測波長條件下， 基線穩定， 能夠得到良好的峰形， 最終確定流動相為甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）為該分析方法的流動相。總之， 本方法操作簡便、準確度高、重現性好， 可用于紫杉醇含量的測定與質量控制。

參考文獻

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 趙惠.紫杉醇周圍神經毒性臨床觀察.中國實用醫藥， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龔奎玉，王志東，李建璜.中國實用醫藥， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.