孤獨癥模型動物認知能力與胃腸功能發育狀況的觀察

張興，李麗娜，林孟柯，寧艷哲，凌雅睿，田小瓏，王茂晉，張忠

孤獨癥又稱自閉癥，是一種由于神經系統失調導致的發育障礙，其表現為不能進行正常的語言表達和社交活動，常做一些刻板和重復性的動作和行為。認知障礙是孤獨癥的核心癥狀之一，可引起嚴重學習、記憶障礙，同時伴有失語、失用、失認或失行等改變。值得注意的是，25%～84%的孤獨癥患兒有胃腸道癥狀，而且胃腸道癥狀與疾病的嚴重程度相關[1-6]。

最近一項研究結果顯示，與正常組兒童對比，孤獨癥患兒便秘和挑食現象更多見[7]。這些現象提示孤獨癥與胃腸癥狀的產生可能有相同的機制。目前這方面的研究還局限于臨床，實驗研究較少。罕見關于孤獨癥模型動物胃腸功能改變的報道。筆者對孤獨癥大鼠發育過程中認知與胃腸功能的變化規律進行了觀察，希望能為后續的機制研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康清潔級SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0001)，雌性，240～260 g 2只，雄性280 g 1只。于北京中醫藥大學科研中心實驗動物飼養中心清潔級大鼠飼養室適應性飼養1周。1周后，每日下午5時，將雄性大鼠與雌性大鼠1只合籠，次日早晨7時觀察飼養籠內的陰栓有無，以確定雌性大鼠是否受孕，以觀察到陰栓出現為受孕第1天。雄鼠休息5 d后，與另一只雌鼠重復此操作。所孕幼鼠出生后即為實驗動物。

1.2 實驗材料 微量電子秤，恒溫水箱，大鼠避暗穿梭箱(北京眾實迪創科技發展有限責任公司，編號：201202098)，曠場實驗視頻分析系統(荷蘭Noldus公司EthoVision系統)，5 mL注射器，灌胃針，活性炭(國藥集團北京化學試劑公司)，生理鹽水，注射用丙戊酸鈉。

1.3 實驗方法

1.3.1 孤獨癥模型建立 12.5 d時對孤獨癥模型孕鼠進行尾靜脈注射丙戊酸鈉(注射用水稀釋為250 g/L，600 mg/kg)，其所生幼鼠為孤獨癥模型組；對照組孕鼠妊娠12.5 d時注射等劑量生理鹽水，其所生幼鼠為對照組。

1.3.2 孤獨癥大鼠模型發育情況 (1)分別測量對照組、模型組幼鼠出生第7、14、21、56天的體質量情況。(2)觀察生后第9、11、13天時幼鼠在25 ℃恒溫箱中的游泳情況，每次1只，觀察5～10 s，計分依據：0分：頭和鼻子均在水下；1分：頭在水上，鼻子在水下；2分：頭和鼻子在水上或與水面齊，但雙耳在水下；3分：水位線在雙耳中間；4分：水位線在耳朵以下。測試后將幼鼠擦干放回籠內。

1.3.3 胃腸感覺和運動功能 (1)結腸疼痛閾值：參考文獻[8]方法并加以改進測定結腸疼痛感覺閾值：以超薄橡膠膜制作氣囊，固定于聚丙烯塑料管上，塑料管一端與氣囊相通，另一端與壓力計和注射器相連接。將帶氣囊的塑料管插至大鼠降結腸，固定。向氣囊內緩慢注氣直至出現腹部肌肉收縮，此時壓力即為疼痛感覺壓力閾值。每只大鼠重復測試5次，每兩次間隔5 min，結果取均值。(2)胃腸通過時間：采用活性炭灌胃法測定首粒黑便排出時間作為胃腸道通過時間，判斷胃腸運動功能。實驗前禁食24 h，次日上午9：00開始用質量濃度為0.1 g/L的活性炭懸液灌胃，觀察幼鼠首粒黑便的排出時間。

1.3.4 學習與記憶能力——避暗反應實驗 避暗儀暗室底部銅柵通36 V、50 Hz交流電，先將幼鼠放入避暗儀反應箱中訓練3 min，正式測試開始時將幼鼠背對洞口放入明室，幼鼠進入暗室則受到電擊，避暗儀自動記錄5 min內幼鼠進入暗室的次數，即為錯誤次數，和首次進入暗室的時間，即為避暗潛伏期。第1天上午9：00開始訓練實驗，次日上午9：00(訓練實驗24 h后)進行測試，記錄5 min內幼鼠避暗潛伏期和錯誤次數。

1.3.5 自發行為與探索行為——曠場實驗 小動物行為學分析系統中將曠場分析箱從左上開始，按左到右順序以不同顏色編號為相同的25個小格，其中7、8、9、12、13、14、17、18、19為中央區域，其余為外周格，13號格為正中格。每次實驗時捏住大鼠尾巴距根部2/3處輕放入13號格中，顯示器中觀察其3 min內活動情況，每次測定結束將動物排泄物清除干凈，每只僅測定1次。實驗時間結束錄像分析，軟件統計。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，數據符合正態性分布，采用t檢驗；不滿足正態性分布，采用非參數檢驗(Mann-WhitneyU檢驗)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠發育狀況

2.1.1 體質量情況 見表1。

表1 孤獨癥大鼠與正常大鼠不同時間體質量比較

注：與對照組比較，az=-2.14，P<0.05，bz=-4.12，-3.89，P<0.01。

表1數據顯示，孤獨癥模型組大鼠體質量在各個時期的平均水平均低于對照組，其中第7、14、21天低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，0.01)。

2.1.2 游泳能力 見表2。

表2 幼鼠游泳能力評分

注：與對照組比較，at=-3.19，-4.42，-3.55，P<0.01。

表2數據顯示，第9、11、13天，孤獨癥模型組游泳能力評分明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 胃腸感覺與運動功能

2.2.1 結腸疼痛閾值 見表3。

表3 幼鼠結腸疼痛閾值

注：與對照組比較，az=-2.41，-2.14，P<0.05，bz=-2.74，-3.23，P<0.01。

表3數據顯示，孤獨癥模型組在第29、36、43、57天與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05，0.01)。對照組幼鼠結腸痛閾基本恒定，而孤獨癥模型組結腸痛閾低于對照組，提示孤獨癥幼鼠發育過程中存在胃腸感覺超敏狀況。

2.2.2 胃腸通過時間 見表4。

表4 幼鼠胃腸通過時間

注：與對照組比較，az=-2.41，P<0.05，bz=-3.34，P<0.01。

表4數據顯示，隨著幼鼠的生長發育，對照組與孤獨癥模型組的胃腸通過時間均逐漸延長，孤獨癥模型組的胃腸通過時間除在第36天長于對照組；其余各時點均短于對照組，第43天胃腸通過時間明顯短于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，0.01)。

2.3 學習與記憶能力——避暗反應實驗 見表5、6。

表5 幼鼠避暗潛伏期

注：與對照組比較，az=-3.06，-2.78，-3.04，P<0.01。

表6 幼鼠避暗錯誤次數次)

注：與對照組比較，az=-3.07，-3.55，-3.31，P<0.01。

表5、6數據顯示，與對照組比較，孤獨癥模型組在初次受到傷害性刺激時，記憶形成不穩固，錯誤次數增多。而多次受到傷害性刺激后，記憶穩固，避暗潛伏期在第37、44、51天均長于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。而避暗錯誤次數僅在第23天高于正常對照組，第30天與對照組基本一致，而第37、44、51天均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。兩項數據均顯示，第58天兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)

2.4 曠場試驗 孤獨癥模型組第29、50天運動距離少于對照組；孤獨癥模型組第50天穿格次數少于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表7、8。

表7 幼鼠總運動距離

注：與對照組比較，az=-2.03，-2.14，P<0.05。

表8 幼鼠穿格次數

注：與對照組比較，az=-2.22，P<0.05。

3 討論

本實驗結果顯示，孤獨癥模型在幼年發育過程中，其體質量增長低于對照組；運動發育和運動協調能力均低于正常水平，游泳能力的不足正說明了這一點。

很早以前，研究者就注意到孤獨癥患兒中存在的胃腸功能障礙[9]。也有研究者認為，伴有胃腸功能障礙的孤獨癥是孤獨癥的一個亞型。有研究結果提示，一些基因可能是孤獨癥和胃腸功能障礙之間的聯系[10-12]，但孤獨癥與胃腸功能障礙之間的關系仍有待于進一步探索。這方面的研究對于闡明孤獨癥的病因病理具有重要的意義。

目前雖然已經建立了多種孤獨癥動物模型，以研究孤獨癥的病理改變機制，但大多數研究都集中在認知障礙方面，很少有關于胃腸功能障礙的機制研究。筆者觀察丙戊酸鈉致孤獨癥幼鼠胃腸功能和認知能力的發育過程，發現該模型幼鼠體質量減輕，在出生第29天就出現胃腸功能障礙，表現為結腸痛閾降低，結腸敏感性增強，胃腸通過時間縮短或延長，胃腸運動障礙。這些與臨床患兒胃腸癥狀相似。說明丙戊酸鈉致孤獨癥大鼠模型可用于研究胃腸功能障礙與孤獨癥內在聯系。

值得注意的是，避暗反應實驗中，孤獨癥幼鼠僅在第1次實驗中錯誤次數高于對照組，第2次實驗錯誤次數與對照組持平，其后各次實驗中，錯誤次數均顯著少于對照組。提示孤獨癥動物對傷害性刺激記憶深刻，這可能是由于模型動物感覺超敏所致。而第37天之后避暗反應潛伏期延長可能與模型動物對傷害性刺激的記憶有關。

曠場實驗中，對照組和孤獨癥模型組幼鼠運動距離隨日齡增加而延長。孤獨癥模型組幼鼠運動距離低于對照組，提示孤獨癥幼鼠自發活動減少。另外，對照組和孤獨癥模型組幼鼠穿格次數均隨日齡增加而延長，孤獨癥模型組幼鼠穿格次數低于對照組，提示幼鼠探索行為減少。

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