誘導多能干細胞研究進展

宋衛華 劉坤 趙同標

（1.中國科學院動物研究所計劃生育生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101；2.山東力明科技職業學院，濟南 250116）

早期人們普遍認為哺乳動物細胞生長發育是一個單向、不可逆過程。隨著分化的進行，發育潛力會逐漸喪失。人類的這一過程起始于精卵結合，終止于220 余種末端成熟分化細胞類型的建立［1］。20世紀30 年代，德國胚胎學家Spemann［2］對這一過程提出猜想——分化的動物細胞是否能像植物體細胞一樣依然具有發育全能性，通過對蠑螈受精卵細胞核在時間與空間的隔離與重新分配，證明初級分化的動物細胞能發育成完整的動物。1952 年，著名發育生物學家Briggs 和 King［3］通過囊胚期細胞核移植試驗證明早期分化細胞的細胞核具有發育為完整個體的能力。1958 年，Gurdon 等［4，5］利用成熟的體細胞——爪蟾腸上皮細胞成功獲得健康的爪蟾個體，在證明動物完全分化細胞具有全能性的同時，使動物細胞發育理論獲得了新的飛躍。1997 年克隆羊多利的誕生，則作為里程碑事件表明，高等哺乳動物的末端分化細胞亦具有全能性。迄今，人們利用這一理論已成功克隆小鼠、大鼠、狗、牛、羊、豬、貓等多種哺乳動物。最近，《細胞》雜志報道了通過體細胞核移植建立人胚胎干細胞的研究，使得動物體細胞全能性這一理論拓展到了高度進化的人類，為人類治療性克隆提供了新的候選方案［6］。

核移植能夠實現細胞重編程，但是對技術要求高，因而制約了其在遺傳發育和生化研究的推廣應用。為此，Stevens 等［7］和Kleinsmith 等［8］建立了來源于畸胎瘤和生殖細胞瘤、具有永生能力的多能性細胞系——胚胎癌細胞（Embryonal carcinoma cells，ECCs）。ECCs 可在體外傳代培養并維持多能性狀態。Miller 等［9］將ECCs 與體細胞（胸腺細胞）進行融合，融合后的雜合細胞具有了ECCs 特性，而喪失了體細胞的特性，表明ECCs 能夠使細胞發生重編程，進而獲得多能性。由于ECCs 細胞是一類腫瘤細胞，不但染色體數目和形態均發生變異，而且分化能力局限，所以后續很少被用來進行重編程研究。取而代之，Tada 等［10］將具有全能性的小鼠胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）與小鼠胸腺細胞進行了融合，并檢測異核體分化能力，發現其具有形成3 個胚層的能力，與ESCs 相似。這一結果表明，ESCs 中存在能夠將體細胞進行重編程的物質，使體細胞獲得多能性。

體細胞核移植和細胞融合技術的發明極大地促進了細胞重編程機理的研究。科學家繼而開始思考：ESCs 或者卵細胞中究竟是什么分子使得分化細胞的命運發生了逆轉。1987 年，Davis 等［11］發現使用帶有MyoD 基因的逆轉錄病毒感染成纖維細胞可將其轉化成肌纖維細胞。這提示通過在某種體細胞中過表達關鍵性轉錄激活因子能夠改變細胞命運，從而實現細胞類型的轉變。隨后，科學家陸續鑒定出細胞中多種調控細胞命運的關鍵轉錄激活因子，并嘗試通過這些因子實現細胞重編程［12，13］。直到2006 年，Yamanaka 研究小組通過篩選ESCs 中特異性表達轉錄激活因子，鑒定出Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4 能夠成功將小鼠成纖維細胞重編程到多能性狀態，并命名誘導得到的細胞為誘導多能性干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）［14］。在iPSCs 建立之初，其是否與ESCs 具有類似的發育潛能一直是科學家們爭論的問題［15］。四倍體補償實驗獲得的完全iPSCs來源的小鼠無可辯駁的證明iPSCs 同ESCs 一樣具有發育成小鼠的全能性［16-18］。2007 年，Yamanaka 研究團隊和美國Thomson 研究小組分別成功建立人的iPSCs［19，20］，為重編程技術應用于臨床帶來曙光。

基于iPSCs 在基礎理論研究的革命性突破和再生醫學應用的重大潛在價值，iPSCs 的研究迅速成為干細胞乃至生物醫學研究領域的前沿熱點。最近的研究工作不僅在重編程方法及機理的認識上有了新的觀點，而且在人類疾病模型及藥物篩選等領域均取得了重要進展。

1 iPSCs 的誘導方法

自iPSCs 建立以來，重編程技術發展迅速。早期iPSCs 系的建立借助于病毒介導的重編程因子轉染［14，19］。病毒介導的方法是細胞重編程機理研究的常見手段，最初的逆轉錄病毒僅能感染分裂旺盛細胞，因而誘導效率一直不高［21］。為此，Maherali 等［22］使用可誘導型慢病毒進行iPSCs 誘導，使誘導效率提高了100 倍以上。盡管病毒誘導能夠快速、穩定的獲得iPSCs，但病毒基因整合到宿主基因組內的持續表達會使細胞內源的部分因子不能被激活［23，24］。此外，病毒基因和活性物質在iPSCs 內的殘留會干擾其發育潛力，還會導致嵌合動物中出現腫瘤［21］。

隨后，科學家們致力于非整合重編程技術的研究。迄今為止，這一技術成功建立，不僅大大提高了重編程的安全性，還為誘導多能干細胞技術向臨床應用奠定了堅實的基礎。普通載體、附加體載體及腺病毒載體介導的轉染技術能夠成功建立小鼠及人的非整合iPSCs，但這種誘導方案存在效率低及篩選工作繁雜等缺陷［25-27］。重編程因子蛋白質的直接轉染技術有望解決基因操作技術的工作量大及繁雜的缺陷，但其極低的誘導效率而使其難以普及應用［28-30］。基于重編程因子RNA 轉染技術亦能夠成功建立非整合iPSCs，目前該技術的普及仍受制于RNA 轉染引起的免疫反應等復雜的技術困擾。值得一提的是微小RNA（microRNA）轉染技術亦被證明能夠建立人的非整合iPSCs［31，32］。2009 年，Judson等發現使用存在于ESCs 時期，與維持多能性相關［33-35］的microRNAs 與4 種轉錄因子共表達可增強iPSCs 的重編程效率［36］。Anokye-Danso 等［31］進一步發現，僅使用microRNA 也可以實現iPSCs 的誘導。使用非整合方法誘導iPSCs 的效率通常遠遠低于病毒載體介導的重編程技術。為解決這一難題，科研人員做了大量的探索。通過在非整合重編程技術誘導過程中添加小分子化合物等方案，使得獲得非整合iPSCs 細胞系的工作越來越容易實現［28，35，37-42］。

新近一項振奮人心的工作發現：在誘導培養基中僅加入7 種小分子化合物FSK、VPA、CHIR、616452、Tranyl、DZNep 和TTNPB，能夠成功的將小鼠成纖維細胞重編程為iPSCs。在小分子誘導系統中，重編程細胞首先激活兩個多能性相關的基因——Sall4 和Sox2，接著胚外內胚層基因Gata6、Gata4 和Sox17 等會隨著表達，進一步使用Oct4 啟動子驅動的熒光素報告基因研究發現，過表達Sall4 和Sox2能夠激活Oct4 的表達，揭示Sall4 介導的分子信號通路在小分子重編程早期發揮作用。此外，Gata6、Gata4 等胚外內胚層基因在重編程過程中的上調，預示著胚胎發育調節基因也參與重編程過程，并且可能為細胞命運決定帶來新的研究熱點。更為有意思的是小分子來源的iPSCs 嵌合鼠存活率達100%，并且都能夠健康生長6 個月以上，極大地避免了嵌合鼠中致畸、致瘤的風險。這暗示小分子來源的iPSCs更容易整合到發育過程中，或許為再生醫學的臨床應用提供新的選擇。這項研究不僅避免了重編程中繁雜的基因操作的煩惱，而且證明了僅通過改變細胞內的關鍵信號通路能夠決定細胞命運［43］。

2 iPSCs 重編程機理

與使用關鍵轉錄因子對體細胞進行細胞類型間轉換的誘導相比，iPSCs 的誘導過程低效、緩慢。Xie 等［12］使用C/EBPα 誘導B 細胞向巨噬細胞的轉化發現，體細胞類型轉化的誘導過程僅需48 h，且轉化率達100%。這表明使用轉錄因子進行iPSCs 誘導比誘導不同體細胞類型間轉換所經歷的阻礙多，可能是體細胞間的表觀差異同體細胞和iPSCs 之間的表觀差異程度不同所致。在重編程過程中，體細胞要經歷DNA 去甲基化、組蛋白去乙酰化、染色體結構調整、多能基因激活，基因組印記去除等一系列復雜生物學過程。為明確體細胞重編程過程中的主要分子事件，Polo 等［44］對iPSCs 誘導過程中所經歷的轉錄譜進行檢測發現，體細胞重編程需要經歷兩個轉錄高峰期，第一波轉錄高峰由c-Myc/Klf4驅動，大概只有5%-10%的細胞可以發生第一波轉錄激活，激活的細胞Thy1、Snai1 和Cdkn2b 表達下調，SSEA1、Alp1 和Cdh1 表達上調，細胞組蛋白修飾、mRNA、microRNA 表達改變。經歷第一波轉錄高峰的細胞僅有很少一部分能起始由Oct4/Sox2/Klf4驅動的第二輪轉錄高峰，進而細胞類型發生轉換，成為具有多能性的細胞。此外，研究還提到，經歷第一波轉錄高峰的細胞處于二價體狀態，倘若使用四因子進行再次誘導，其還可以轉換成為多能性細胞。這一研究表明重編程過程并非是一個連續的非可逆過程，處于重編程中間狀態的細胞具備轉換成完全重編程細胞的能力，并且不會由于發生重編程起始而導致細胞阻滯到特定時期。Polo 等所提到的重編程過程的兩個轉錄波是細胞重編程的群體效應。Buganim 等［45］則對單細胞的重編程過程進行檢測，也得到類似的結論。Takikawa 等［46］在此基礎上研究了重編程中的基因印跡情況發現，小鼠iPSCs 產生過程中Snrpn 和Peg3 印跡區域的甲基化會消失，而且，雙親起始特異性表達的Snrpn 和Zim1 基因印跡也會消失，并在某些iPSCs 中還存在一條到多條染色體印跡區的無甲基化，為iPSCs 重編程中基因印跡的研究帶來新發現。

體細胞重編程過程還伴隨著復雜的細胞狀態轉換，Liu 等［47］使用順序誘導的方法（iPSCs 誘導時，首先引入Oct4/Klf4，然后c-Myc，最后Sox2）研究了重編程過程中細胞狀態轉換，發現誘導之初，細胞首先會激活一個早期的由上皮型向間充質型的轉換階段（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），此時，Slug 和N-cadherin 會發生上調；接著會出現一個延遲的間充質型向上皮型的轉變（Mesenchymalto-epithelial transition，MET）。如果在早期EMT 發生時使用TGF-β 處理細胞1.5 d，就能夠提高重編程效率，而處理12 d 則會阻滯重編程的進行。這表明在重編程過程的早期EMT-MET 對于重編程的起始起關鍵作用。Bedzhov 等［48］進一步研究了細胞類型轉換中起主要作用的黏附因子對于iPSCs 多能性建立和維持所發揮的作用。他們使用單基因替代的基因敲入方法將N-cadherin（N-cad）或E-cadherin（E-cad）/N-cad 嵌合鈣黏著素整合到E-cad 基因位點發現，經敲入的ESCs 都能維持未分化狀態，維持Nanog 等多能性基因的表達，且夠在體內外實現完全分化；進一步將E-cad 敲除則發現ESCs 丟失了上述特性。因此，E-cad 介導的細胞黏著是iPSCs 產生所必須，且試驗證實E-cad 敲除的成纖維細胞不能重編程。而N-cad 與E-cad 相似，有效地促進了細胞重編程，對于MET 轉換起始發揮關鍵作用。這一結果豐富了E-cad 與多能性相關，N-cad 與分化相關的結論。

盡管ESCs 和iPSCs 在自我更新和發育多能性方面較接近，但有科學家提出iPSCs 與ESCs 在基因表達和分化能力上并非完全一致［49］。研究發現，雖然iPSCs 和ESCs 在細胞表面標記蛋白的表達上相同，且能產生畸胎瘤，但其發育潛力存在細微的差異［14，50，51］。2008 年，Mikkelsen 等［24］發現完全 重編程的細胞在基因表達和表觀狀態上更接近ESCs，而部分重編程細胞則在干細胞相關基因的表達上存在抑制。2010 年，Stadtfeld 等和liu 等［52，53］發現位于第12 號染色體的qF1 位置的Dlk-Dio3 基因族的沉默，會引起不完全重編程的發生。2011 年，Mattout等［54］對小鼠iPSCs 重編程過程中組蛋白（H3ac、H4ac、H4K5ac、H3K9ac、H3K27ac、H3K4me3、H3K36me2、H3K9me3、H3K27me3 和γH2AX） 修飾變化檢測發現，完全重編程細胞在組蛋白水平與ESCs 相似，而部分重編程細胞則存在顯著差異。2013 年，Razak 等［55］從miRNA 水平分析人的ESCs和iPSCs 發現，iPSCs 在19 號染色體miRNA 簇的表達明顯高于ESCs，表明了iPSCs 與ESCs 間的差異，然而造成這一差異的調控機理還不清楚。此外，不同方法誘導產生的iPSCs 之間也存在差異，因而是否存在與生理條件來源ESC 完全一致的細胞系，或如何優化重編程條件獲得同生理條件來源完全一致的iPSCs 是尚未回答的科學問題。

另外，近年的研究工作使人們對細胞重編程機理有了新的認識。研究發現，將核小體重構和去乙酰化抑制復合物中的核心成員Mbd3/NuRD 敲除的細胞進行iPSCs 誘導，幾乎所有的體細胞都能重編程為iPSCs，這挑戰了傳統對于重編程過程的認識。這項研究還揭示了4 種重編程因子在重編程過程中的雙重作用：激活內源多能性網絡的同時，直接刺激細胞募集Mbd3/NuRD 復合物進而抑制4 種因子下游靶基因的激活。這使4 種因子在重編程過程的抑制作用受到重視，也揭示出轉錄因子介導的重編程過程并非都是促進細胞分化［56］。另有研究表明，胚胎發育時期的特定基因對細胞重編程過程也發揮作用，研究人員通過試驗證實核心轉錄因子中的Oct4 和Sox2 能夠被中胚層和外胚層的標記基因所替代，并提出“蹺蹺板模型”解釋了胚胎發育與細胞重編程的關系。這些研究表明iPSCs 的產生過程并非完全是一個發育分化的逆過程，不同胚層發育之間的競爭很可能貢獻于iPSCs 多能性的獲得，這在一定程度上解釋了重編程效率極低的原因［57］。

3 iPSCs 臨床研究

iPSCs 的臨床研究主要集中在疾病模型和細胞治療兩個方面。

許多退行性疾病如I 型糖尿病、老年癡呆癥和帕金森綜合癥等是臨床的疑難病癥，發病分子機理還遠未清楚，同時傳統的藥物及手術等治療很難治愈。基于干細胞技術的細胞替代治療被認為是最有希望治療這些疾病的手段。理論上講，患病個體來源的iPSCs 不僅能夠為體外研究疾病發生的分子機理提供革命性的工具，其體外分化的相應細胞組織還可為細胞替代修復病變組織提供可能，而且，這些iPSCs 分化來的相應細胞組織能為體外篩選有效藥物提供新的平臺。美國的Chae 研究小組建立了研究亨廷頓氏病病人特異的iPSCs，并與正常人的iPSCs 進行蛋白組學比較，發現未分化階段的兩種iPSCs 存在26 種蛋白表達差異，而這些蛋白與氧化應激、細胞凋亡以及細胞氧化代謝相關，進一步研究發現SOD1 和Prx 家族蛋白主要影響病人來源的iPSCs，進而導致其細胞對氧化應激的敏感［58］。這一模型的建立極大地推動了疾病特異藥物的開發和疾病機理的研究。目前，許多退行性疾病如帕金森綜合癥［59］、肌萎縮性脊髓側索硬化癥［60］、阿爾茨海默病［61］等的iPSCs 紛紛建立，這極大地促進了針對個體疾病的發病機理和新藥研發，亦為未來針對病人個體的細胞替代治療奠定了基礎。體外獲得的iPSCs 極大地便利了科研人員對疾病的研究，但是體外培養還存在與體內環境的較大差異。2013 年，Lancaster 等［62］利用三維培養技術，將人的ESCs 誘導分化成為大腦皮層組織，并且使用前、中、后腦特定的標記蛋白檢測了三維培養得到的大腦組織，確定了分化的大腦組織的功能區域形成。他們還通過RNA 干擾技術將病人來源的iPSCs 構建成為小頭畸形的疾病模型，為研究更為復雜的組織病變提供了借鑒。

在細胞治療方面，由于人體之間存在個體差異，因而使用異體器官移植極易引起免疫排斥反應，需要服用抑制機體免疫的藥物進行維持，但藥物本身所帶來的副作用對身體的傷害是不可想象的。此外，異體器官移植需要找到合適的供體，而現今捐獻器官的人數有限，也使得異體器官移植受到很大程度的限制。為此，如果使用個體特異的成體細胞誘導成為iPSCs，則可以解決上述一系列問題，還可以通過同源重組來修復導致疾病的基因突變。早在2007年，這一想法已經在鐮刀形貧血癥小鼠模型上證明是可行的［63］。之后，Yan 等［64］將小鼠iPSCs 自體移植到心肌梗塞的小鼠體內發現，移植后的iPSCs能夠形成血管平滑肌細胞和內皮細胞，并且對于心臟功能有所改善，進而證明iPSCs 進行細胞治療可以應用到疾病模型的治療。為了更好地模擬iPSC 在治療人類疾病中的作用，2013 年，Morizane 等［65］將靈長類iPSCs 來源的神經細胞進行自體和異體移植發現，自體移植的iPSCs 來源的神經細胞幾乎不會引起免疫排斥反應，并且體內存活細胞數目多，而異體移植的iPSCs 則會引起體內的獲得性免疫反應，激活體內的小神經膠質細胞（BA-1+/MHC class II+），并且有白細胞（CD45+/CD3+）浸潤。這一發現極大地鼓舞了iPSCs 在移植治療的中應用，并且為iPSCs 應用于人類疾病奠定了重要的理論依據。近期，Schwartz 等［66］研究人員使用人ESCs 來源的視網膜色素細胞進行移植治療退行性黃斑病變，經過一段時間的觀察發現，病人的視覺感知能力有所提升。這一探究為臨床應用iPSC 技術提供了很好的范例。

4 展望

盡管iPSC 研究仍是一個相對年輕的領域，但自發現以來領域內不斷取得重大研究進展。隨著對重編程分子機理認識的加深，重編程方法的改進，更多的研究致力于將iPSC 技術應用于臨床。在重大退行性疑難疾病、單基因遺傳病等的疾病模型及藥物篩選等領域iPSC 越來越顯示出其強大的優勢。iPSC技術在小鼠鐮刀形貧血癥等疾病治療中的成功運用為臨床應用iPSC 技術治療人類疾病帶來了希望。

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