淫羊藿素抗骨肉瘤的機制探究

劉玉亮， 殷嫦嫦， 張義平， 梁廣勝， 魏強強， 殷 明

（1.南昌大學第二附屬醫院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大學研究生院醫學部， 江西 南昌 330006；3.九江學院醫學部分析與檢測實驗室， 江西 九江 332000）

淫羊藿素抗骨肉瘤的機制探究

劉玉亮1，2， 殷嫦嫦3， 張義平3， 梁廣勝1，2， 魏強強1，2， 殷 明1*

（1.南昌大學第二附屬醫院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大學研究生院醫學部， 江西 南昌 330006；3.九江學院醫學部分析與檢測實驗室， 江西 九江 332000）

目的 探討淫羊藿素致 Saos2 細胞凋亡及抑制其增殖的可能機制。 方法 采用不同質量濃度梯度淫羊藿素作用于人骨肉瘤 Saos2 細胞及用抗氧化劑預處理過的骨肉瘤細胞， 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態； 流式細胞儀檢測不同條件下細胞活性氧的情況及凋亡情況； 劃痕實驗檢測淫羊藿素對細胞增殖遷移的影響； 用終濃度為 100 μmol/L的氯化鈷模擬骨肉瘤的缺氧環境， RT-PCR檢測血管內皮生長因子 （VEGF）、 尿激酶型纖溶酶原激活劑受體 （ uPAR）、 基質金屬蛋白酶 2 （ MMP2） 、 腎上腺髓質素 （ ADM） 、 烯醇酶-1 （ Enolase-1 ） 及醛縮 酶 A （ aldolase A） 基因 表達的情況。結果 淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞活性氧水平較陰性對照組明顯增高，抗氧化劑預處理組可降低細胞活性氧水平且可逆轉淫羊藿素的致凋亡作用， 淫羊藿素可下調 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A基因的表達。 結論 淫羊藿素能致骨肉瘤 Saos2 細胞凋亡可能跟細胞內活性氧的上調相關， 增殖抑制可能與 HIF1 下游基因如 VEGF、uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A的表達下調有關。

淫羊藿素； Saos2 細胞； 增殖抑制； 凋亡

淫羊藿素可以致骨肉瘤 Saos2 細胞凋亡并能下調 HIF1α的表達， 凋亡的信號通常有 兩條通路：由細胞內的信號變化導致細胞色素c釋放入胞質及線粒體膜電位的降低激活細胞凋亡蛋白酶［1］； 一條是由細胞外死亡配體與死亡受體結合然后最 終激活 caspase家族［2］。 正 常 情況下細胞內活性氧 （ROS） 的產生和清除處于平衡的狀態，以保證細胞的穩態和正常的生理活動，腫瘤細胞由于抗氧化酶低于正常細胞，所以其細胞內的活性氧處于高水平［3］， 大量學者研究表明 ROS在上述的兩條凋亡通路上發揮作用［4］。 抑制腫瘤的增殖主要通過抑制腫瘤血管的新生、抑制腫瘤的糖酵解能力、抑制腫瘤的轉移及免疫逃逸能力等來實現， 因為常氧下 HIF1α經過反應被泛素化降解， 所以本實驗用 100μmol/L的氯化鈷模擬低氧環境來研究 HIF1 的下游 基因的表 達［5］， 本實驗即探究淫羊藿素在體外致腫瘤凋亡作用與細胞內 ROS 水平的關系， 增殖及轉移的抑制與 HIF-1α的下游基因血管內皮生長因子 （VEGF）、 尿激酶型纖溶酶原激活劑受體 （uPAR）、 基質金屬蛋白酶 2 （MMP2）、 腎上腺髓質素 （ADM）、 烯醇酶-1 （ Enolase-1） 及醛縮酶 A （ aldolase A） 表達的關系。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 淫羊藿素 （上海源葉生物科技有限公司， 淡黃色粉末狀， HPLC測定純度 ＞98%，批號為20120207）； N-乙酰半胱氨酸、 活性氧檢測試劑盒 （Sigma）； PCR試劑盒、 胎牛血清 （TRANS）；DMEM/F-12 培養基 （HyClone）； RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒 （康為世紀）。二甲基亞砜、胰蛋白酶、 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、 瓊脂糖、TAE （Solarbio）；CKK-8 細胞活力檢測試劑盒 （北京莊盟國際生物基因科技有限公司）。

1.2 主要儀器 臺式室溫高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）； 超低溫冰箱 （Haier）； 手提式不銹鋼壓力蒸氣滅菌器 （上海三申醫療器械有限公司）；多功能酶標儀 （BIO-RAD公司）； 冷凍高速離心機 （珠海黑馬醫學儀器有限公司）； CO2細胞孵箱 （SIM公司）； 超凈工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）； PCR儀 （杭州博日科技有限公司）； 電泳儀 （美國 伯樂公司）；流式細胞儀 （BD公司）。 倒置相差顯微鏡（NIKON公司）；凝膠成像系統 （SIM公司）。

1.3 細胞株 人骨肉瘤細胞株 Saos2 來自本實驗室庫存。

2 實驗方法

2.1 細胞生長及形態學觀察 培養人骨肉瘤細胞株 Saos2， 分別適量接種于 24 孔細胞培養板中待細胞穩定生長良好， 兩組細胞以 10 mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 預處理2 h 后分別加終濃度為20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培養基， 另兩組分別直接更換終濃度為 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培養基， 培養 48 h后， 倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長及形態學變化，評價 NAC預處理過的細胞與直接加淫羊藿素細胞的生長狀況的差別及形態學的不同。

2.2 細胞凋亡流式檢測 利用 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染料流式細胞分析技術檢測 NAC預處理對淫羊藿素致人骨肉瘤 Saos2 細胞凋亡作用的影響， 24 孔培養板常規培養骨肉瘤 Saos2 細胞， 待其生長良好， NAC組細胞以 10 mmol/L的 NAC預處理 2 h后分別加終濃度為 20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培養基， 藥物組分別直接更換終濃度為 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培養基， 不加任何處理的為陰性對照， 培養 48 h后， 按凋亡試劑盒操作說明進行操作，用流式細胞儀分析結果。

2.3 細胞活性氧檢測 6 孔培養板常規培養骨肉瘤 Saos2 細胞， 待其生長良好， 藥物組加終濃度為50 μmol/L淫羊藿素培養基分別培養 6、 12、 24 h，NAC組先用 10 mmol/LNAC預處理細胞 2 h， 再加入 50 μmol/L淫羊藿素培養 12 h， 不加任何處理的為陰性對照， 后收集細胞加含終濃度為 10 μmol/L DCFH-DA的無血清 DMEM， 在 37 ℃培養箱中避光孵育 30 min， 每 3 ～5 min 將細胞顛倒混勻一下。孵育結束后， 用冰冷的 PBS 溶液洗滌細胞 2 次，充分除去未結合的探針，上機檢測。

2.4 劃痕實驗 種 6 孔板， 分兩組： 正常組、 氯化鈷 （CoCl2） 組 （100 μmol/L CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 待細胞狀態良好后， 用 100 μL槍頭在板上輕柔的劃兩條直線， 兩直線距離大于 1 cm， 然后用 PBS 沖洗干凈殘留的細胞， 然后按分組加上不同的培養基， 然后分別在 6、 12、24 h 拍照。

2.5 RT-PCR檢測 常規種板 （6 孔板） ，分 3組： 空白組 （未做 任 何 處 理組）、 氯 化 鈷 組（100 μmol/L CoCl2） 、 陽 性 對 照 組 （ 100 CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 每組設 4 個復孔。 24 h按照康為世紀 RNA提取和逆轉說明書進行操作， 以逆轉后的 cDNA為模版擴增檢測 VEGF、uPAR、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A mRNA的 表達擴增后制膠跑電泳拍照， 用 image J軟件分析灰度值。見表1。

表1 各目的基因及內參基因的引物序列Tab.1 Prim er sequences of target gene and the con trol gene

2.6 統計學處理 采用 SPSS 16.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析， 檢驗水準 α=0.05。

3 結 果

3.1 細胞生長及形態學觀察 用以 10 mmol/L的NAC預處理2 h能明顯逆轉不同終濃度淫羊藿素所致的 Saos2 細胞凋亡， 細胞凋亡數目明顯減低， 但和陰性對照組細胞還是存在細胞收縮變圓，并且有明顯的凋亡小體存在。 見圖1。

圖 1 細胞形態學觀察 （100 倍）Fig.1 Cellular morPhology observation（ ×100）

3.2 細胞凋亡流式檢測 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染料流式細胞分析技術：左下象限：正常存活細胞，左上象限：壞死細胞，右上象限：早期凋亡細胞，右下象限：晚期凋亡細胞。淫羊藿素作用于 Saos2 細胞及用 NAC預 處理的細胞后結果顯示： 用 NAC預處理2 h可以逆轉淫羊藿素致凋亡作用， 且差異具有統計學意義 （P＜0.05）， 但其凋亡率還是顯著高于對照組，提示淫羊藿素致Saos2 細胞凋亡作用可能跟淫羊藿素促氧化作用有關。 見圖2。

圖 2 流式細胞儀檢測淫羊藿素促 Soas2 細胞凋亡作用及不同狀態細胞的百分比柱狀圖Fig.2 APoPtosis effect on Soas2 cells of icaritin

3.3 活性氧檢測結果 DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞， 經胞內的酯酶水解作用轉化生成 DCFH在活性氧作用下，DCFH被氧化成發熒光的 DCF。 細胞內 ROS的水平與 DCF的熒光強度成正比。 同對照組比較， Saos2 細胞經 50 μmol/L淫羊藿素作用后可導致熒光強度增加， 表明細胞內的 ROS在增加。 隨著作用時間延長胞內 ROS水平逐漸增高并在 12 h 達到峰值， 而后 ROS 水平逐漸回落但至 24 h 胞內 DCF熒光強度仍然顯著高于對照組水平。6、 12、24 h 后細胞內的平均熒光強度分別為57.5% （P＜0.05）、124.9% （P＜0.05）、 64.6%（P＜0.05）， 增多的 ROS 可以被抗氧化劑 NAC所阻斷。 見圖3。

3.4 劃痕實驗 結果顯示： 陰性對照組細胞生長迅速，有明顯的向遠處生長轉移的趨勢，劃痕處有明顯的細胞存在，而加藥組生長明顯受到抑制，細胞數量比對照組明顯減少，劃痕處無細胞出現且細胞凋亡明顯， 說明淫羊藿素有阻抑 Saos2 細胞增殖轉移的作用。 見圖4。

3.5 RT-PCR結果 各組處理 24 h 后結果： 與 A組相比， CoCl2組的 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、Enolase-1 表 達 水 平 均 升 高， 差 別 有 統 計 學 意 義（ P＜0.05） ， 而 aldolase A表達水 平差異 無統計學意義 （P＞0.05）； 與 CoCl2組相比， CoCl2+淫羊藿組 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 的表達明顯降低， 差 別 均 有 統計學意義 （ P＜0.05）， 而uPAR、 aldolase A的表達與 CoCl2組相比差別無統計學意義。說明用 CoCl2模擬缺氧可以使 Saos2 高表達 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因，而對 aldolase A無明顯影響， 而淫羊藿素可以降低在 Saos2 在缺氧環境下 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因的表達， 而對 uPAR、 aldolase A無明顯影響。 見圖5。

4 討論

圖 3 流式細胞儀檢測淫羊藿素對細胞內 ROS水平的影響Fig.3 Effect on intracellular ROS level of icaritin

圖 4 劃痕實驗 （100 倍）Fig.4 Scratch tests（ ×100）

活性氧主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等，正常情況下細胞內活性氧的產生和清除處于平衡的狀態，以保證細胞的穩態和正常的生理活動［6］。 腫瘤細胞由于超氧化物歧化酶 （ SOD）、 過氧化氫酶 （CAT） 等抗氧化酶低于正常細胞， 所以其細胞內的活性氧處于高水平［7］。 降低 ROS 水平可以抑制腫瘤細胞的增殖，ROS水平增高在細胞增殖、凋亡相關的信號轉導通路中也同樣發揮著重要作用［8］。 有學者研究發現 ROS 致凋亡可能和 Fas受體途徑相似， 因為抗氧劑可以阻抑 Fas受體途徑誘導的凋亡， 并且 ROS 和 Fas受體和配體的基因表達密切相關［9-10］。 ROS 通過線粒體途徑致凋亡主要是由于使線粒體 Ca2+的超載， 然后線粒體膜電位降低致線粒體膜通透性增加最終導致細胞色素c從線粒體釋放入細胞質激活 Caspase家族， 另外線粒體 Ca2+的超載可以反作用使 ROS 水平升高［11］。還有學者研究發現過多的 ROS 高表達 Bcl家族的促凋亡基因 Bax是線粒體膜通透性增加從而導致細胞色素 c釋放激活 Caspase家族導致凋亡［12］， 本實驗中發現淫羊藿素致能使 Saos2 細胞內 ROS 量增高致細胞凋亡， 淫羊藿素的致 Saos細胞凋亡作用能被 NAC逆轉， 說明淫羊藿素致 Saos細胞凋亡跟高表達其細胞內 ROS水平相關。

圖 5 淫 羊 藿 素 對 Soas2 細 胞 VEGF、 uPAR、MM P2、 ADM、 Enolase-1 及 aldolase A基因表達的影響Fig.5 Effects of icaritin on VEGF， uPAR， MMP2，ADM， Enolase-1 and aldolase A exPression in Saos2

腫瘤的增殖跟諸多基因相關［13］， 如向遠處轉移的基因、在缺氧條件下利用營養的基因及血管新生的基因等：向遠處轉移主要通過分泌周圍基質消化的酶如 uPAR、 MMP2 等， 從而消化周圍的機制促進腫瘤細胞向遠處的轉移；大量研究表明腫瘤細胞利用能量主要通過糖酵解來完成，因此高表達與糖酵解相關的酶如 ADM、Enolase-1 等在腫瘤增殖過程中發揮著重要作用；血管的新生跟很多生長因子如 PDGF、 VEGF等基因相關， 此類基因可以促進血管的形成。上述各基因都受 HIF1 轉錄因子所調節，本實驗在前期研究中發現淫羊藿素在基因水平上下調 HIF1α， HIF在轉錄水平上發揮作用需要低氧環境抑制 HIF1α的降解， 因為 HIF1α在常氧情況下可以被脯氨酸羥化酶羥化，羥化后被泛素化降解，因此本實驗在研究與增殖抑制相關基因即HIF1 的下游基因時用氯化鈷來模擬腫瘤細胞的相對缺氧環境，結果證實氯化鈷組高表達了上述基因，說明缺氧環境模擬成功。本實驗發現淫羊藿素可以下調細胞增殖遷移相關基因 VEGF、uPAR的表達， 且能降低 Saos2 糖酵解相關基因如 ADM、Enolase-1 的表達， 從而影響了腫瘤細胞血管的新生、降解細胞外基質、在缺氧環境下利用營養的能力，從而影響腫瘤的增殖轉移的能力。

淫羊藿素致 Saos細胞凋亡跟高表達其細胞內ROS水平相關， 增殖轉移的抑制作用應更進一步的分子水平的研究，用相關技術如沉默相關基因觀察細胞的生物學性狀的變化，進一步驗證相關基因與增殖抑制的關系。

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M echanism of anti-osteosarcoma of icaritin

LIU Yu-liang1，2， YIN Chang-chang3， ZHANG Yi-ping3， LIANG Guang-sheng1，2， WEIQiang-qiang1，2，YIN Ming1*
（1.The Second Hospital Affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China； 2 Graduate School of Medicine， Nanchang University， Nanchang 330006， China； 3 Analysisand Test Laboratory of Jiujiang University， Jiujiang 332000， China）

AIM To investigate the inhibitory proliferation of icaritin and its induction of apoptosis on Saos2 cells.METHODS Saos2 cells and their pretreated cellswith antioxidantwere incubated with different concentrations of icaritin， and then the change of the cellmorphologywas observed by the invertedmicroscope.Flow cytometry instrumentwas used for the detection of reactive oxygen species（ ROS） and apoptosis ratio of the cells.The scratch test for cellmigration and proliferation， under the hypoxic condition simulated by cobalt dichloride（100 μmol/L） for analog of anoxic environment of osteosarcomat， and RT-PCR for measurement of VEGF， uPAR，MMP-2， ADM， Enolase-1 and aldolase A gene expression in cells were performed.RESULTS Icaritin can increase the ROS of Saos2 as compared with the control group， antioxidant pretreatment antagonized apoptosis ratio and relative gene expression.CONCLUSION Icaritin-inducing Saos2 apoptosismay be associated with upregulation of intracellular reactive oxygen，and Icaritin's proliferation inhibition is related to down-regulation of HIF1 downstream genes such as VEGF， uPAR， MMP2， ADM， Enolase-1 and aldolase A expression.

icaritin； Saos2 cells； proliferation inhibition； apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0004-06

,ebook=10

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.002

2013-05-19

劉玉亮 （1987—） ， 男， 碩士生， 研究方向： 中藥抗骨腫瘤。 Tel： 18653844696， E-mail： 283401832@qq.com

*通信作者： 殷 明 （1958—）， 男， 碩士生導師， 研究方向： 端粒酶基因阻抑椎間盤退變。 Tel：（0791）86298917