商陸皂苷甲致肝毒性的研究

周 倩， 姚廣濤， 金若敏， 謝家駿

（上海中醫藥大學 藥物安全評價研究中心， 上海 201203）

商陸皂苷甲致肝毒性的研究

周 倩， 姚廣濤*， 金若敏， 謝家駿

（上海中醫藥大學 藥物安全評價研究中心， 上海 201203）

目的 通過體外、 體內實驗相結合的方法考察商陸皂苷甲所致的肝毒性。 方法 MTT法測肝細胞 （ L-02 細胞）活力； 以不同質量濃度的商陸皂苷甲與肝細胞共培養后， 測細胞培養上清中的 AST（谷草轉氨酶）、 ALP（堿性磷酸酶） 和 LDH （乳酸脫氫酶） 水平， 并在光鏡下對細胞形態進行觀察； Hoechst-PI雙標染色觀察細胞的凋亡和壞死情況； 取 KM種小鼠分為正常組和給藥組， 給藥組的小鼠每天尾靜脈注射 10mg/kg商陸皂苷甲， 連續給藥 7 d， 考察小鼠血清肝功能指標和肝組織的病理學變化。 結果 MTT的結果顯示， 商陸皂苷甲能顯著抑制肝細胞活力， 其 IC50為360.18 μg/mL； 400 μg/mL的商陸皂苷甲能升高細胞培養上清中的 AST、 ALP和 LDH （ P＜0.01） 并使肝細胞出現變圓、 減少和死亡的現象； 300 和 350 μg/mL的商陸皂苷甲能使肝細胞發生凋亡和壞死； 體內實驗表明， 小鼠血清中的AST和 ALT（谷丙轉氨酶） 水平均明顯升高 （P＜0.01）， 小鼠肝臟多出現肝細胞多發灶性壞死及肝細胞再生現象。結論 大劑量的商陸皂苷甲對肝臟具有一定的毒性作用。

商陸皂苷甲；肝毒性；肝細胞；小鼠

中藥商陸系商陸屬植物商陸 Phytolacca acinosa Roxb.和垂序商陸 Phytolacca americana L.的干燥根， 其味苦、 性寒， 有毒， 歸肺、 腎、 大腸經［1］。現代藥理研究發現，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫和祛痰平喘等作用，主治急慢性腎炎、血小板減少性紫癜、腎水腫、銀屑病和慢性氣管 炎 等［2-3］。商 陸 皂 苷 甲 為 商 陸 的 主 要 成 分 之一［4］，具有顯著的抗炎、 免疫抑制、提高 DNA的合成率等作用［5-6］。 商陸 在臨床應用中的不 良反應時有報道，但有關其毒理方面的研究較少，本實驗選用商陸中的主要成分商陸皂苷甲，采用體外與體內實驗相結合的方法，考察其肝毒性。

1 材料

1.1 細胞株 L-02 細胞株 來自上海中科院細胞庫。

1.2 試劑及材料 商陸皂苷甲 （上海融禾醫藥科技 發 展 有 限 公 司， 純 度 ＞98%，批 號 為120417）； DMEM 培 養 基 （ 美 國 Gibco公 司 ） ；MTT（ 美國 Sigma公司）；Hoechst 33342 （ 美 國Sigma公司） ； PI（ 美國 Sigma公 司） ； 胎牛血 清（美國 Hyclone公司） ； 青 霉 素-鏈 霉素抗體 （ 美國 Gibco公 司） ； 胰 蛋白酶 （ 美國 Sigma公 司 ） ；DMSO （國藥集團化學試劑有限公司）；谷草轉氨酶 （AST）、 谷丙轉氨酶 （ ALT）、 堿性磷酸酶 （ALP） 和乳酸脫氫酶 （LDH） 均購于日本世諾臨床診斷制品株式會社。

1.3 儀器 全自動酶標儀 （BioTek 公司）； 熒光倒置 相 差 顯 微 鏡 （ Olympus公 司）； CO2培 養 箱（Thermo公司）； 日立 7080 全自動血液生化儀 （日本日立貿易有限公司）。

2 方法

肝細胞 （L-02 細胞） 采用的完全培養液為：DMEM培養液 +1%青霉素-鏈霉素抗體 +10%胎牛血清。

2.1 商陸皂苷甲對肝細胞活力的影響 參考文獻［7］，采用 0.25%胰酶消化處于對數生長期的肝細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度約為7 ×104個 /mL， 接 種 于 96 孔 板 中 （每 孔 180 μL）。 孵育 24 h 后分別以含 150、 200、 250、300、 350、 400 μg/m L商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞，另設不加藥的陰性平行對照組，每組平行 4 孔， 置 37 ℃ CO2培養箱中培養。 20 h后每孔避光加入 20 μL MTT溶液， 置培養箱中繼續培養。 4 h 后棄上清， 每孔加入200 μLDMSO溶解藍紫色結晶， 另設 DMSO調零孔， 酶標板振蕩混勻， 在酶標儀 570 nm檢測波長處測定吸光度A，按公式計算細胞活力，并將給藥組與對照組進行統計分析，實驗重復 3次。公式：細胞活力%=［（給藥組平均 A-調零孔 A） ÷（對照組平均 A-調零孔 A）］ ×100%。

2.2 商陸皂苷甲對肝細胞上清功能性指標及細胞形態學的影響 參考文獻［7］， 采用 0.25%胰酶消化處于對數生長期的肝細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度約為 18 ×104個/mL， 接種于 24 孔板中（每孔 900 μL）。 孵育 24 h 后分別以含 100、 200、300、400 μg/mL商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞另設不加藥的陰性平行對照組，每組平行3孔，置37 ℃ CO2培養箱中培養。 藥物作用24 h 后用倒置相差顯微鏡對細胞形態學進行觀察，立即取細胞培養上清， 1 200 r/min 離心 5 min， 取上清， 采用全自動血液生化儀對肝細胞培養上清液中的 AST、ALP和 LDH進行檢測。

2.3 Hoechst-PI雙標染色觀察細胞的凋亡和壞死情況 同 “2.2” 項對細胞進行處理， 其中商陸皂苷甲 的 給 藥 質量濃度設 為 200、 250、300、350 μg/mL， 給 藥 24 h 后， 加 入 1 mg/m L的 Hoechst33342 （體系中終質量濃度為 10 μg/m L）， 37℃避光反應 10 min 后加入 1 mg/mL的 PI（ 體系中終質量濃度為 10 μg/mL）， 4 ℃ 避 光反應 20 min后，立即用倒置熒光顯微鏡進行觀察。

2.4 商陸皂苷甲對小鼠肝毒性的影響 KM小鼠 20 只 （雌雄各半）， 進行隨機分組， 即分為正常對照組和給藥組。給藥組小鼠每天尾靜脈注射 10 mg/kg的商陸皂苷甲， 連續 7 d， 正常組尾靜脈注射等容量的生理鹽水，于末次給藥1 h后， 進行摘眼球取血， 血漿靜置 30 min 后 3 500 r/min 離心15 min，分離 出 血 清， 全 自 動 血 液 生化儀測 ALT和 AST，另取小鼠肝臟，對其進行組織病理學檢查。 參考文獻［8］， 進行半定量分析：肝組織結構正常，無明顯變性、壞死及炎癥細胞浸潤，記為0分；肝小葉結構尚正常，可見明顯的混濁腫脹、氣球樣變或脂肪變性，散在點狀壞死 （+）， 記為 1 分； 肝小葉結構不清，可見明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細胞浸潤（++）， 記為2 分； 肝小葉結構不清、 可見明顯的片狀壞死，伴有炎癥細胞浸潤 （+++），記為3分；壞死細胞彌漫性存在于肝小葉中央，層次較多， 伴有炎癥細胞浸潤 （++++）， 記為4分。

3 結 果

3.1 商陸皂苷甲對肝細胞活力的影響 與對照組相比， 給予 300 ～400 μg/mL商陸皂苷甲 24 h 后，各組的肝細胞活力均明顯下降，有極顯著性差異（P＜0.01 或 0.05 ），且 呈 劑 量 依 賴 性，IC50為360.18 μg/mL， 見表 1。

表 1 商陸皂苷甲對 L-02 細胞活力的影響 （， n=4）Tab.1 L-02 cell viability in fluenced by esculentoside A（， n=4）

表 1 商陸皂苷甲對 L-02 細胞活力的影響 （， n=4）Tab.1 L-02 cell viability in fluenced by esculentoside A（， n=4）

注： 與對照組相比，**P＜0.01，*P＜0.05

組 別 質量濃度/（ μg·m L-1） A 細 胞活 力/%對 照- 0.440 ±0.024 100.00 ±5.45 150 0.405 ±0.048 92.05 ±10.91 200 0.419 ±0.038 95.23 ±8.64商陸皂苷甲 250 0.411 ±0.025 93.41 ±5.68 300 0.385 ±0.009* 87.50 ±2.05*350 0.272 ±0.030** 61.82 ±6.82**400 0.026 ±0.009** 5.91 ±2.05**

3.2 商陸皂苷甲對肝細胞上清功能性指標及細胞形態學的影響 與對照組相比， 400 μg/mL組的肝細胞上清液中的 AST、 ALP、 LDH水平明顯升高， 有顯著性差異 （P＜0.01）， 見表 2。 正常肝細胞貼壁生長，細胞緊密銜接且呈不規則的多邊形； 400 μg/m L商 陸皂苷甲組的 肝 細 胞明顯變圓、減少、部分死亡且漂浮于培養液中，細胞 輪 廓 清 晰， 內 可 見 大 量 空 泡 產 生； 300 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細胞內可見部分空泡產生； 100 和 200 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細胞形態無明顯的改變，見圖1。

表 2 商陸 皂苷甲對 L-02 細胞功能性 指標的影響 （，n=3）Tab.2 Contents of AST， ALP， LDH in L-02 cell suPernatant influenced by esculentoside A（， n=3）

表 2 商陸 皂苷甲對 L-02 細胞功能性 指標的影響 （，n=3）Tab.2 Contents of AST， ALP， LDH in L-02 cell suPernatant influenced by esculentoside A（， n=3）

注： 與對照組相比，**P＜0.01

組 別 質量濃度/（ μg·mL-1）AST /（IU·L-1）ALP /（IU·L-1）LDH /（IU·L-1）對 照- 3.67 ±0.58 26.00 ±1.00 74.33 ±1.53 100 3.33 ±0.58 25.00 ±0.00 72.33 ±1.15商陸皂苷甲 200 3.33 ±0.58 24.33 ±0.58 71.33 ±1.53 300 4.00 ±0.00 25.67 ±1.15 75.00 ±2.65 400 13.67 ±0.58**31.33 ±1.53**189.00 ±3.46**

圖 1 商陸皂苷甲對 L-02 細胞形態的影響 （ ×200）Fig.1 M orPhological changes of L-02 cell influenced by esculen toside A （ ×200）

3.3 Hoechst-PI雙標染色觀察細胞的凋亡和壞死情況 正常對照組肝細胞數較多，細胞多呈淡藍色，亮藍色的早期凋亡細胞和橘紅色的晚期凋亡或壞死細胞為個別現象； 200 和 250 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細胞未發生明顯改變；隨著劑量增大，300 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細胞數量逐漸減少，凋亡和壞死細胞逐漸增加； 350 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細胞數量顯著減少且凋亡和壞死的細胞明顯增多。見圖2。

圖 2 商陸皂苷甲對 L-02 細胞形態的影響 （ ×200）Fig.2 L-02 cell aPoPtosis and necrosis infulenced by esculentoside A（ ×200）

3.4 商陸皂苷甲對小鼠肝毒性的影響 與正常對照組相比， 商陸皂苷甲組小鼠血清中的 ALT和AST水平均出現明顯的升高 （P＜0.01）， 見表 3；光鏡下觀察，與對照組相比商陸皂苷甲組小鼠肝臟多出現肝細胞多發灶性壞死及肝細胞再生 （P＜0.01）， 見表4 及圖 3。

4 討論

商陸皂苷甲是中藥商陸的主要成分與活性成分之一，臨床大量服用商陸可引起消化系統損害，最先出現的不良反應是胃腸道癥狀，如惡心嘔吐、食欲減退、腹脹、腹痛、腹瀉，嚴重者可出現胃腸道糜爛、 潰瘍及出血， 呈現嘔血、 便血等［9］。 在誤服商陸引起的中毒事件中，部分患者出現了肝功能的異常［10-12］ 。

表3 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對血清生化指標的影響 （， n=10）Tab.3 Serum biochem ical indexes of KM m ice after being given esculentoside A for 7 days（， n=10）

表3 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對血清生化指標的影響 （， n=10）Tab.3 Serum biochem ical indexes of KM m ice after being given esculentoside A for 7 days（， n=10）

注： 與對照組相比，**P＜0.01

組 別 劑量/（mg·kg-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）正常對照組- 31.38 ±3.08 102.80 ±15.68商陸皂苷甲組 10 360.14 ±287.97**265.21 ±125.02**

表4 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對肝病理改變的影響Tab.4 HePatic histoPathology of KM m ice after being given esculen toside A for 7 days

圖 3 商陸皂苷甲對小鼠肝組織病理學的影響 （ ×200）Fig.3 HePatic histoPathology of KM m ice after being given esculentoside A（ ×200）

體外實驗研究 表 明， 300 ～400 μg/m L商 陸 皂苷甲對肝細胞活力有明顯的抑制作用，且呈量-效關系。 400 μg/mL商陸皂苷甲組能顯著升高肝細胞培養上清液中的 AST、 ALP和 LDH水平。 細胞形態學方 面 的影響主要 表 現 為 400 μg/m L商 陸 皂 苷甲組的肝細胞明顯變圓、減少、部分死亡且漂浮于培養液中，細胞輪廓清晰，內可見大量空泡產生。300 和 350 μg/mL的商陸皂苷甲能使肝細胞不同程度的發生凋亡和壞死現象， 且呈現一定的量-效關系。以上的結果均表明商陸皂苷甲對肝細胞具有毒性。

體內實驗研究表明， 給 予 10 mg/kg商 陸皂苷甲 7 d 后， KM小鼠血清中的 ALT和 AST水平出現明顯的升高，肝組織出現明顯的病變，顯示大劑量的商陸皂苷甲對肝臟有較強的毒性作用。

商陸皂苷甲在中藥商陸中的量約為 0.4%［4］，其既是有效成分又是毒性成分，本研究提示在大劑量下，商陸皂苷甲對肝臟具有一定的毒性作用，提示在臨床上使用商陸應予以注意，特別是對肝功能不良的患者。

［ 1 ］ 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典［S］.2010 年版一部.北京： 中國醫藥科技出版社， 2010.

［ 2 ］ 李一飛， 姚廣濤.商陸藥理作用及毒性研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（13）： 248-251.

［ 3 ］ 張家繼， 李革李， 德 君.商陸的臨床應用［J］.中國中醫急癥， 2011， 20（6）： 1002.

［4］ 馬 杰，賴道萬，孫文基.商陸藥材中商陸皂苷甲的含量測定［J］.藥物分析雜志， 2010， 30（1）： 163-165.

［ 5 ］ 馬華林， 張欣洲， 張祥貴.商陸皂苷甲對 BXSB狼瘡性腎炎小鼠的治 療 作 用 ［ J］.廣 東 醫 學， 2011， 32 （12）：1540-1542.

［ 6 ］ Hu Z， Qiu L， Xiao Z， et al.Effects ofesculentoside A on autoimmune syndrome induced by Campylobacter jejuni in mice and itsmodulation on T-lymphocyte proliferation and apoptosis［ J］ . Inter Immuno pharmacol， 2010， 10（1） ： 65-71.

［7］ 張 茜，周 綺，金若敏， 等.吳茱萸次堿對肝腎毒性的初步研究［ J］.中國實驗 方劑學雜志， 2011， 17 （8）：221-225.

［8］ 周 綺，張 茜，金若敏.吳茱萸致小鼠肝毒性時效、 量效關系研究［ J］.中國實驗方劑學雜志， 2011， 17 （9）：232-235.

［9］ 胡 瑩， 曾聰彥， 梅全喜.急性商陸中毒反應82 例文獻分析［J］.時珍國醫國藥， 2011， 22（12）： 3041.

［10］ 陳金香.中西醫結合治療急性商陸中毒 26 例［J］.浙江中醫雜志， 2010， 45（7）： 535.

［11］ 郭寶科， 張風琴， 張 黎， 等.急性商陸中毒 10 例臨床分析［ J］ .中國工業醫學雜志， 2005， 18（1） ： 32-33.

［12］ 汪曉風.2 例商陸中毒病人的救護［ J］.護理研究， 2008，22（1）： 183.

HePatotoxicity induced by esculentoside A

ZHOU Qian， YAO Guang-tao*， JIN Ruo-min， XIE Jia-jun
（Shanghai University of Traditional ChineseMedicine， Shanghai201203， China）

AIM To explore the hepatotoxicity of esculentoside A from Phytolacca acinosa Roxb.in vitro and in vivo.METHODS MTT assay was used to test the hepatic cells（ L-02 cell） viability.The contents of aspartate aminotransferase（ AST） ， alkaline phosphatase（ ALP）and lactic dehydrogenase（ LDH） in hepatocytes supernatantwere detected after being incubated with the different concentrations of esculentoside A andmorphological changes of hepatocytes were observed by inverted phase contrastmicroscope.Cell apoptosis and necrosis were observed by Hoechst-PI stainingmethod.After 10 mg/kg esculentoside A were given tomice for 7 days through intravenous administration， hepatic function and histopathology inmice was investigated.RESULTS The MTT result showed that esculentoside A could obviously inhibit hepatic cells viability with the IC50of 360.18 μg/mL. 400 μg/mL esculentoside A could increase the levels of AST， ALP， LDH in hepatocytes supernatant（ P＜0.01 ）and cellmorphology showed that 400 μg/mL esculentoside A could damage the shapes of hepatocytes.Three hundred and 350 μg/mL esculentoside A caused cell apoptosis and necrosis.The animal experiment showed that AST and alanine aminotransferase（ALT） in blood serum increased notably（ P＜0.01） .Histopathological examination revealed thatmost ofmice’ s livers had multiple focal necrosis of liver cells and liver regeneration.CONCLUSION Esculentoside A may cause hepatotoxicity.

esculentoside A； hepatotoxicity； hepatocytes； mice

R969

： A

： 1001-1528（2014）01-0014-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.004

2013-02-06

國家重點基礎研究發展計劃 （973 計劃） （2009CB522807）； 國家 “十二五” 科技重大專項課題 “中藥安全評價技術平臺”（2011ZX09301-009）

周 倩 （1988—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥安全性評價。 E-mail： 423384692@qq.com

*通信作者： 姚廣濤， 博士， 副研究員， 碩士生導師， 從事中藥新藥及其安全性評價研究。 Tel： （021） 51322472， E-mail： ygt1969@ yahoo.com.cn