白花丹參提取物對脂多糖損傷內皮祖細胞周期與凋亡的影響

焦 鵬， 楊娜娜， 唐瑜菁， 秦樹存

（ 泰山醫學院 動脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000）

白花丹參提取物對脂多糖損傷內皮祖細胞周期與凋亡的影響

焦 鵬， 楊娜娜， 唐瑜菁， 秦樹存*

（ 泰山醫學院 動脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000）

目的 探討白花丹參提取物對脂多糖損傷內皮祖細胞周期與凋亡的作用。 方法 以 10 μg/mL脂多糖誘導內皮祖細胞損傷， 制備內皮祖細胞損傷模型后用不同質量濃度白花丹參提取物干預， 用 MTT比色法檢測各組細胞活性，用 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡變化， 碘化丙啶單染流式細胞儀檢測各組細胞周期。 結果 與正常對照組比較，模型組細胞增殖活性明顯下降， 細胞凋亡率明顯增加， S 期細胞比率降低， G0/G1期細胞比率增加。 與模型組比較，白花丹參組細胞存活率升高， 細胞凋亡率下降， 且呈劑量依賴性， G0/G1期細胞比率降低， S 期及 G2/M期細胞比率均增加。結論 白花丹參對脂多糖損傷的血管內皮祖細胞有保護作用，其機制可能是通過保護細胞周期正常進行、抑制細胞凋亡實現的。

白花丹參；內皮祖細胞；細胞周期；凋亡；增殖

我國近年來動脈粥樣硬化的發病率呈現逐年上升和年輕化趨勢［1］。血管內皮細胞功能受損是導致動脈粥樣硬化形成的始動環節，保護血管內皮功能是防治動脈粥樣 硬化的 重要手 段之一［2-3］。 內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血 管的修 復［4-5］。丹參是唇 形科鼠尾草屬植物，是治療心腦血管病的常用中藥，其活性成分主要包括脂溶性和水溶性兩大類，這兩類成分在動脈粥樣硬化發生的各個階段均具一定作用［6］。本研究所使用的白花丹參采自泰山，屬稀有罕見的名貴中藥材，是丹參族中的極品。本實驗擬在脂多糖致血管內皮祖細胞損傷模型上研究白花丹參水溶性提取物對受損內皮祖細胞的影響。

1 材料

1.1 藥 物 和 細 胞 白 花 丹 參 Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba采自泰山， 白花丹參提取物的制備和人臍血內皮祖細胞的培養和鑒定參照本課題組發表的文獻， 即參考文獻 ［7］。

1.2 試劑 EBM-2 培養基購自 Lonza公司； MTT，PI， AnnexinV/PI染色試劑盒均購自南京凱基生物科技公司； 脂多糖， DMSO購自 Sigma公司。

1.3 儀 器 流 式 細 胞 儀 （BD FACSCalibur，美國）， RE-52A型旋轉蒸發儀 （上海亞榮生化儀器廠）， SHBⅢ型循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）， 酶標儀 （550 型， 美國 BIO-RAD公 司 ）， 圖 像 分 析 系 統 Lasersharp2000 軟 件（v4.5.3， 美國 BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 實驗分組 將體外培養的臍血內皮祖細胞隨機分為3組：正常對照組不予任何處理，脂多糖損傷組用 10 μg/m L脂多糖處理 12 h 誘導內皮祖細胞損傷，白花丹參干預組用脂多糖誘導內皮祖細胞損傷后用不同質量濃度 （0.2、 0.4、 0.8 g/L） 白花丹參提取物干預12 h。

2.2 細胞活力的檢測 將處于對數生長期的細胞以 1.2 ×104個/孔的密度加入 96 孔板中， 每孔 100 μL培養基， 每組設6個復孔， 生長過夜后， 分別按以上分組處理， 12 h后棄原培養基， 各孔加入含 0.5 mg/LMTT的培養液， 繼續孵育 4 h 后棄上清， 每孔加 DMSO 150 μL， 充分振蕩 30 min 后在490 nm測定每孔的吸光度 A值， 對結果進行統計分析。

2.3 細胞凋亡的檢測 按分組處理細胞后， 分別收集各組漂浮細胞和用胰酶消化下的細胞， PBS 洗2 次，1 100 r/min離心 5 min 后去上清， 按照試劑盒的說明書進行 AnnexinV/PI染色后， 立即進行流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 胰酶消化實驗組和對照組細胞制備單細胞懸液， 加入 75%的冰乙醇， 4 ℃ 固 定 過 夜， 1 100 r/min 離 心 5 min， 細 胞用 PBS 洗 2 次后加入 10 μg/mL的 RNaseA， 37 ℃作用 30 min，加 入 10 μg/mL的 碘 化 丙 啶 染 料， 4℃閉光染色 30 min 后上機檢測， 用 CellQuest軟件獲取細胞后用 Modifit軟件分析各組細胞的周期分布， 分 析 G0/G1期、 S 期 和 G2/M 期 細 胞 所 占比例［8］。

3 結果

3.1 內皮祖細胞的活力檢測 不同質量濃度白花丹參提取物對脂多糖損傷后內皮祖細胞活力的影響見圖 1。 結果顯示， 10 μg/m L脂多糖作用內皮祖細胞后，細胞活力受到明顯的抑制，不同質量濃度白花丹參干預后細胞活性高于單純損傷組，白花丹參提取物質量濃度在 0.8 g/L時達到最大效應（圖1）。

圖1 內皮祖細胞的活力檢測Fig.1 Endothelial Progenitor cells viability test

3.2 內皮祖細胞的凋亡檢測 內皮祖細胞的凋亡通過流式細胞儀 AnnexinV-FITC/PI染色法來檢測。結果 如 圖 2， AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測結 果 表明，沒有經過處理的內皮祖細胞只有一小部分細胞發生凋亡， 而 10 μg/mL脂多糖與內皮祖細胞孵育12 h 后能明顯誘導細胞凋亡， 而 0.8 g/L白花丹參處理后能明顯抑制脂多糖引起的細胞凋亡 （圖2）。

3.3 內皮祖細胞的周期檢測 流式細胞儀檢測不同分組處理后內皮祖細胞的 DNA水平揭示了內皮祖細胞周期分布的變化。 如圖 3， 10 μg/m L脂多糖處理細胞后， G0/G1期細胞比率較正常對照組明顯增加， S 期細胞百分比低于對照組 （P＜0.01）。因此，脂多糖對內皮祖細胞生長的抑制作用可能是通過 G0/G1期阻滯來實現的。 與模型組比較， 白花丹參組細胞 G0/G1期細胞比率降低， S 期及 G2/M期細胞比率均增加，0.8 g/L白花丹參處理后，S期細胞比率與模型組比較有顯著差別，且白花丹參提取物高、 低質量濃度藥物組的 G0/G1期與正常對照組差異無統計學意義 （P＞0.05）。 見流式細胞儀 PI染色 DNA倍體分析結果 （圖 3A） 及統計分析結果 （圖 3B）。

圖 2 流式細胞儀 AnnexinV-PI雙染檢測內皮祖細胞的凋亡率Fig.2 Flow cytom etry Annexin V-PI double staining detected aPoPtosis of endothelial Progenitor cells

圖3 流式細胞儀 PI染色不同分組處理后內皮祖細胞的周期分布Fig.3 PI staining flow cytometry detection of different grouPs of endothelial Progenitor cycle distrihution

4 討論

從學術角度分析，內皮祖細胞的概念雖然提出僅僅十幾年，但研究進展迅速，業已證明內皮祖細胞在血管內皮系統保護和損傷修復中發揮關鍵作用［9-10］。本課題組的前期工作已經證明氧化低密度脂蛋白可以損傷內皮祖細胞的功能，而新近有文獻報道丹參提取物可以提升外周血中內皮祖細胞的數量［11］。國內研究發現丹參對高膽固醇血癥患者外周血內皮祖細胞數量無顯著影響但顯著提高內皮祖細胞的功能， 但其機制尚不清楚［12］。 因此， 丹參對心血管系統的保護作用，可能部分地與增加了內皮祖細胞數量、提高其功能有關，極有可能亦促進內皮祖細胞的損傷修復功能［13］。

丹參中水溶性的活性成分主要為酚酸類化合物， Chan 等研究發現， 在丹參水提物修復內皮細胞功能失調的過程中，不同類型的成分表現出較大差異，水提物的作用效果優于丹參素、原兒茶酸等化學單體［14-15］。 本研究 在前期 研究工作的基礎上，在動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一脂多糖致血管內皮祖細胞損傷模型上，進行拓展性研究，評價動脈粥樣硬化的危險因素存在下白花丹參對受損內皮祖細胞的保護作用。本實驗觀察到泰山白花丹參水提物在 MTT實驗中所獲得的最強藥效濃度下對脂多糖 （10 μg/mL）誘導的內皮祖細胞凋亡具有明顯的抑制作用而且對脂多糖造成的細胞周期阻滯現象有明顯改善作用，為白花丹參發展為血管保護藥物提供新的實驗數據和理論依據。由于中藥在使用過程中多以復合物而非純品的形式存在，丹參在體內可能涉及到多種成分的相互作用，因此多種丹參成分之間的協同作用機制在動脈粥樣硬化治療過程中具有更加重要的意義。

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Effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract on cell cycle and aPoPtosis of endothelial Progenitor cells injured by LPS

JIAO Peng， YANG Na-na， TANG Yu-jing， QIN Shu-cun*
（Institute of Arteriosclerosis， Taishan Medical College， Taian 271000， China）

Salviamiltiorrhiza Bunge.f.alba；endothelial progenitor cells； cell cycle； apoptosis； proliferation

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0022-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.006

2013-03-18

山東省中醫藥科技發展計劃項目 （2011-228）； 山東省自然科學基金 （Z2008C03）； 國家自然科學基金 （30971098）； 山東省自然科學基金 （ZR2012HL18）

焦 鵬 （1979—） ， 女， 講師， 碩士， 研究方向： 細胞生物學。 Tel： 13854826934 E-mail： jiaopeng196@163.com

*通信作者：秦樹存，教授，研究方向：脂質代謝與動脈粥樣硬化。

ABSTRACT： AIM To explore the effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extracton the cell cycle and apoptosis of endothelial progenitor cells injured by lipopolysaccharide（ LPS）.METHOD The injury to endothelial progenitor cellswas induced by 10 μg/mL LPS and Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract had been intervening in endothelial progenitor cells.Changes of cellular morphology were detected with microscope.The viability of the cells in each group was examined by MTT method.Flow cytometry Annexin V/PI staining was used for apoptotic changes and PI staining for analysis of the effect of the cell cycle.RESULTS Compared with the control group，LPSdecreased the proliferative activity and increased the rate of cell apoptosis.Flow cytometry PIstaining showed there weremore cells arrested atG0/G1stage and less cells at S stage in LPSdamage group，rather the other way around in Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract group.CONCLUSION Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extractmay have significant protective effect on the endothelial progenitor cells injured by LPS and related to the protection of normal cell cycle and the decrease in the cell apoptosis.