高效液相色譜-二極管陣列法同時測定三黃血清口服液中 5 個成分

張 平， 俞永梅， 儲忠英

（上海市松江食品藥品檢驗所， 上海 201600）

高效液相色譜-二極管陣列法同時測定三黃血清口服液中 5 個成分

張 平， 俞永梅， 儲忠英

（上海市松江食品藥品檢驗所， 上海 201600）

目的 建立 HPLC-DAD法同時測定三黃血清口服液 （黃芪， 黃芩， 黃柏， 黨參， 白術(shù)等） 中 5 個成分 （原兒茶醛、 綠原酸、 黃芩苷、 丹酚酸 B、 漢黃芩素） 的量。 方法 采用 HPLC-DAD方法， ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色譜柱； 流動相為乙腈 （ A） -0.1%磷酸溶液 （ B） 梯度洗脫， 體積流量 1.0 mL/min， 柱溫為 30 ℃， 檢測波長為 278 nm （原兒茶醛、 黃芩苷、 漢黃芩素）、 286 nm （丹酚酸 B）， 320 nm （綠原酸）。 結(jié)果 5 個成分的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好， 加樣回收率為 97.7% ～101.6%。 結(jié)論 該方法簡便、 準(zhǔn)確、 靈敏， 重復(fù)性好， 可用于三黃血清口服液中多種指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制。

三黃血清口服液；原兒茶醛；綠原酸；黃芩苷；丹酚酸B；漢黃芩素；多波長

三黃血清口服液是由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院委 托上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的純中藥制劑，其成分主要由黃芪、黃芩、黃柏、黨參、白術(shù)、茯苓、木通、 丹參、 牡丹皮、 紅花、 苦參、 銀花等 17味組成，具有清熱潤燥、活血散積的作用，主要用于治療銀屑病 （也就是俗稱的牛皮癬）。本品為傳統(tǒng)的口服液，《上海市食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) SYZ-ZF-002-2009》 中只有對幾味藥材的薄層鑒別，缺少成分定量測定，無法有效評價各指標(biāo)成分的內(nèi)在質(zhì)量。黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎等功效。銀花具有清熱解毒，涼血止痢，祛風(fēng)散邪等功效。丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。為了更好地控制藥品質(zhì)量，保證公眾用藥的安全有效，本實驗對這三味主要藥材中的5種主要成分進行定量測定。目前對 5 個成分中其中 幾 個成分的測 定 報 道 較 多［1-14］，3種藥材中各個有效成分的量在同一系統(tǒng)測定未作任何報道。本研究以制劑中的黃芩、丹參和銀花作為研究對象， 采用 HPLC-DAD梯度洗脫法在同一條件下、不同檢測波長下分別測定三黃血清口服液中原兒茶醛、綠原酸、黃芩苷、丹酚酸 B、 漢黃芩素5個成分的量。經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果令人滿意，為該制劑的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent HP 1100 高效液相色譜儀 （包括真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、紫外檢測器、 二極管陣列檢測器）； 天平 AG 135 （0.01 mg，METTLER TOLEDO）； ZORBAX SB-C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純， 水為超純水，磷酸為分析純。 對照品原兒茶醛 （1） （ 批號 110810-201007）、 綠原酸 （2） （批號 110753-200413）、 黃芩苷 （3） （批號 110715-200815）、丹酚酸 B （4）（批號 111562-201110）、漢黃芩素 （5） （批號1514-200001） 均來源于中國藥品生物制品檢定所。三黃血清口服液，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院生產(chǎn)，批號為 20111028 （ 該批號為建立方法所用批號）、20110623、 20111022、 20111030。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取原兒茶醛、綠原酸、 黃芩苷、 丹酚酸B、 漢黃芩素5個對照品適量， 加50%甲醇分別制成每 1 m L分別含原兒茶醛 38.88 μg、 綠原酸 409.2 μg、 黃芩苷 792.0 μg、丹酚酸 B59.66 μg、漢黃芩素 20.18 μg的溶液作為對照品貯備溶液， 再分別吸取 5.0 mL置 50 mL量瓶中， 加 50%甲醇稀釋至刻度作為對照品混合溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取 10 mL， 置 50 mL量瓶中， 用 50%甲醇振搖提取稀釋至刻度， 搖勻，用微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方量制備缺黃芩、丹參、銀花的陰性樣品， 按 “2.1.2”項下方法制成陰性樣品溶液，備用。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察 采用 ZORBAX SB-C18色譜柱 （4.6mm×250 mm， 5 μm）； 流動相梯度洗脫見表 1； 體積流量 1.0 m L/min； DAD檢測器， 檢測波長 278 nm （原兒茶醛、 黃芩苷、 漢黃芩素）， 286 nm （ 丹酚 酸 B）， 320 nm （ 綠 原酸）； 柱溫 30 ℃；進樣量 10 μL。 理論板數(shù)均不低于 10 000； 各成分之間的分離度均大于 1.5。 在上述色譜條件下，對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。 由圖1可見， 樣品色譜圖中色譜與對照品色譜相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品無相應(yīng)峰，說明樣品中其他成分對以上5個成分的測定無干擾。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取上述對照品溶液 2、 5、 10、 20、30 μL，注入高效液相色譜儀， 按 “2.2” 項下色譜條件進行測定， 以各個對照品進樣量 （ng） 為 X軸， 峰面積值為 Y軸計算回歸方程、 相關(guān)系數(shù)和線性范圍。 見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.2 Regression equations、 correlation coefficient and linear range

2.4 精密度試驗 精密吸取對照品混合溶液 10 μL， 按上述色譜條件連續(xù)進樣 6 次， 記錄各色譜圖的峰面積。結(jié)果原兒茶醛、綠原酸、黃芩苷、丹酚酸 B、 漢黃芩素峰面積 RSD （n=6） 分別為0.8%、 0.3%、 0.2%、 1.6%、 0.7%。 表明儀器精密度良好。

圖1 對照品混合溶液 （A）、 供試品溶液 （B）、 缺黃芩藥材的陰性對照溶液 （C）、 缺丹參藥材的陰性對照溶液 （D）、 缺銀花藥材的陰性對照溶液 （E） HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of references（ A），sam Ples （ B） ， negative sam Ple w ithout Scutellariae Radix （ C） ， negative sam Ple w ithout Salviae M iltiorrhizae Radix et Rhizoma （ D）， negative samPle Lonicerae Japonicae flos（E）

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品 （批號 20111028），按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在 0、4、 8、 12、 24 h 進行測定， 測得峰面積并計算原兒茶醛、綠原酸、 黃芩苷、 丹酚酸 B、 漢黃芩素的RSD （ n=5 ） 分 別 為 1.0%、 0.8%、 0.8%、1.7%、0.9%。 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗 取批號為 20111028 的樣品， 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液， 按 “2.2” 項色譜條件測定，進行6次平行試驗，結(jié)果原兒茶醛、綠原酸、黃芩苷、丹酚酸B、漢黃芩素的平均質(zhì)量 濃 度 分 別 為 22.33、 312.3、 655.2、 53.21、19.31 μg/mL。 RSD （ n=6 ） 分 別 為 1.9%、0.8%、 0.5%、1.7%、 2.0%。

2.7 加樣回收率試驗 分別精密量取已知含有量的樣品 （批號 20111028） 5 mL置 50 mL量瓶中，精密加入 “2.1.1” 項 下 對 照品 貯 備 溶液 2.0、2.5、 3.0 m L， 每組 3 份， 共 9 份， 加 50%甲醇定容至刻度。 按 “2.1.2” 項下方法制備供試品溶液， 按 “2.2” 項色譜條件測定， 計算回收率。 結(jié)果見表3。

表 3 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

2.8 樣品測定 取3 批樣品， 每批平行測定 3 次，按 “2.1.2” 項下的 方 法 制 備供試品溶 液，按“2.2” 項色譜條件進行分析， 記錄峰面積， 按外標(biāo)法計算。 結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取上述 5 個對照品， 在200 ～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果原兒茶醛、 黃芩苷與漢黃芩素在 278 nm波長處有最大吸收，丹酚酸 B在 286 nm波長處有最大吸收，綠原酸在320 nm波長處有最大吸收。 所以本實驗采用 DAD檢測器，在3個波長處同時測定5個成分，結(jié)果很穩(wěn)定。

表 4 樣品測定結(jié)果 （μg·m L-1）Tab.4 Assay results of sam Ples（ μg·m L-1）

3.2 流動相的選擇 本實驗采用不同流動相比例的甲醇-0.6% 冰 醋 酸 溶 液［2］、 乙 腈-0.4% 磷 酸 溶液［7］、甲醇-乙腈-水-甲酸［8］、 乙 腈-0.05% 三氟乙酸［10］進行比較， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶 液梯度洗脫時，使各色譜峰保持良好的峰形，分離度均大于1.5， 理論板數(shù)均超過了 10 000， 并且陰性對照色譜中無干擾峰的出現(xiàn)。

3.3 溶劑的選擇 本品是口服溶液， 采用不同比例的甲醇水溶液提取主成分， 發(fā)現(xiàn) 50%的甲醇振搖提取成分含有量最高，所以選擇 50%甲醇作為提取溶劑，方法簡便易行。

3.4 小結(jié) 本品是本市的醫(yī)院制劑， 參照醫(yī)療機構(gòu)醫(yī)院制劑標(biāo)準(zhǔn)，缺少成分定量測定，未能有效地控制本制劑的質(zhì)量。中藥復(fù)方制劑總是由多味藥組成，所以其藥效是有很多種活性物質(zhì)同時發(fā)揮而達到治療效果。所以為了更好地控制本制劑的質(zhì)量，本研究采用 HPLC-DAD法對三黃血清口服液中的 5個成分 （原兒茶醛、 綠原酸、黃芩苷、丹酚酸 B、漢黃芩素）采用梯度洗脫，進行同時測定，用DAD檢測器驗證5 個對照品與樣品中 5 個成分的匹配度與光譜圖均一致。本方法樣品處理簡便，方法準(zhǔn)確，可為該制劑制定新的檢測方法與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考價值。

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Sim ultaneous determ ination of five com Ponents in Sanhuang Serum Oral Liquid by HPLC-DAD

ZHANG Ping， YU Yong-mei， CHU Zhong-ying
（Shanghai Songjiang Institute for Food and Drug Control， Shanghai201600， China）

AIM To develop an HPLC-DADmethod for determining five components，including protocatechuic aldehyde， chlorogenic acid， baicalin， salvianolic acid B and wogonin in Sanhuang Serum Oral Liquid （ Astragali Radix， Scutellariae Radix， Phellodendri chinensis Cortex， Codonopsis Radix， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， etc.）.M ETHODS Five components were analyzed on ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）with acetonitrile-water（containing 0.1%phosphonic acid） as mobile phases in gradient elution manner， 1.0 m L/min of flow-rate and 30 ℃ of temperature of column.The detection wavelength was set up at278 nm for protocatechuic aldehyde， baicalin， and wogonin， 286 nm for salvianolic acid B， and 320 nm for chlorogenic acid.RESULTS Five componentswere seperated perfectly and good liner relationshipswere obtained.The recoverieswere 97.7%-101.6%， respectively.CONCLUSION The developed method is simple， specific， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Sanhuang Serum Oral Liquid.

Sanhuang Serum Oral Liquid； protocatechuic aldehyde； chlorogenic acid； baicalin； salvianolic acid B；wogonin； multiwavelength

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0094-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.023

2013-02-03

張 平 （1979—） ， 女， 主管藥師， 從事藥品質(zhì)量研究及檢驗工作。 Tel： 13917001643， E-mail： flyingzp@sina.com