酶解輔助提取金芪降糖片中生物堿的工藝研究

南 楠， 寧 娜，2， 孟利娜， 謝憲斌， 周 晶*， 王 欣

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300070； 2.貴州省銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系， 貴州 銅仁 554300； 3.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠， 天津 300457）

酶解輔助提取金芪降糖片中生物堿的工藝研究

南 楠1， 寧 娜1，2， 孟利娜1， 謝憲斌1， 周 晶1*， 王 欣3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300070； 2.貴州省銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系， 貴州 銅仁 554300； 3.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠， 天津 300457）

目的 考察酶解輔助提取技術(shù)對金芪降糖片中生物堿提取率的影響，優(yōu)選出生物堿的最佳提取工藝條件。方法采用正交試驗(yàn)， 考察酶用量， pH， 溫度以及酶解時(shí)間對金芪降糖片中生物堿提取率的影響。 結(jié)果 優(yōu)化酶解法的最佳提取工藝條件為： 加入相當(dāng)于藥材質(zhì)量 0.6%的纖維素酶， 在 pH4.5， 35 ℃條件下酶解 3.0 h， 可將小檗堿提取率提高 29.98%， 黃連總生物堿提高 30.17%。 結(jié)論 酶解-冷浸法提取黃連生物堿簡便可行， 不僅生物堿浸出率高，而且適合工業(yè)化生產(chǎn)。

酶輔助提取；金芪降糖片；生物堿；小檗堿；正交試驗(yàn)

金芪降糖片是治療非胰島素依賴性糖尿病的經(jīng)典方劑，由黃連、金銀花和黃芪3味藥組成，其中主要成分為四大類： 生物堿類、 有機(jī)酸類、 黃酮類和皂苷類［1］。 既往研究發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片可改善胰島素抵抗個(gè)體的胰島素敏感性，降低血壓和血糖［2］， 還可糾正多囊卵巢綜合征患者的肥胖狀態(tài)，調(diào)節(jié)糖代謝，調(diào)節(jié)雄激素的合成，改善多囊卵巢綜合征患者的生殖調(diào)節(jié)軸［3］。 金芪降糖片拆方實(shí)驗(yàn)已明確其降血糖作用是以黃連［4］為主， 黃芪、 金銀花為輔［5］。 金芪降糖片在生產(chǎn)過程中黃連是直接以原藥材細(xì)粉入藥，為了縮減金芪降糖片的服用劑量從而提高患者用藥的順應(yīng)性［6］， 本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選黃連生物堿常規(guī)提取工藝基礎(chǔ)上， 采用纖維素酶輔助提取金芪降糖片中黃連中的生物堿，并通過正交試驗(yàn)篩選出黃連生物堿酶解輔助提取的工藝方法，用以提高黃連中有效成分的浸出率，減少耗能，縮短提取時(shí)間，從而達(dá)到更有效利用黃連藥材資源的目的。

1 材料

美國 Waters高效液相色譜儀； Millennium系統(tǒng)工作站、2484雙波長吸 收檢測器、 515 雙 泵、 Waters恒 溫柱溫 箱；SZ-93 自動雙重純水蒸餾水器 （上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）；BP-211D電子分析天平 （ 德國賽多利斯公司） ； KS-600D超聲清洗 機(jī) （ 寧 波 科 生 儀 器 廠 ） ； 黃 連 為 雞 爪 黃 連 Coptis chinensis Franch.的干燥根 （ 天津中新藥業(yè)隆順榕制藥廠提供， 由天津醫(yī)科大學(xué)生藥教研室周曄教授鑒定）， 符合《中國藥典》 2010 年版一部要求； 鹽酸藥根堿， 鹽酸巴馬汀，鹽酸小檗堿對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110713-200908、 110732-200806、 0733-200905）； 纖維素酶 （天津利華酶制劑技術(shù)有限公司， 濾紙酶活力5 109.52 U/g， 批號 為 10-03-19 ） ， 乙腈為 色譜純， 水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材中生物堿測定 根據(jù)前期工作的方法學(xué)考察結(jié)果［8］對黃連藥材主要生物堿進(jìn)行了定量測定。 結(jié)果見表 1。

表1 黃連中生物堿測定結(jié)果

2.2 金芪降糖片生物堿酶輔助提取單因素試驗(yàn) （n=2）

2.2.1 纖維素酶液的配制 準(zhǔn)確稱取 500 mg纖維素酶，用 pH4.5 的蒸餾水溶解后定容至 100mL量瓶中， 此酶液質(zhì)量濃度為 5 mg/mL， 經(jīng)濾紙酶活力法［9］測定纖維素酶活力為： 5 109.52 U/g。

2.2.2 酶解液 pH值的考察 稱取 10 g黃連 9 份， 置于100m L三角瓶中， 加入8 倍量、 以硫酸水分別調(diào)成 pH1.4、3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.8， 纖維素酶用量均為藥材質(zhì)量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中溫?zé)?3.5 h 后， 按初步篩選優(yōu)化的提取條件， 加入 8 倍量 0.25%硫酸水， 冷浸提取 2 次， 每次 24 h， 收集、 合并提取液， 濃縮定容于100mL量瓶中， 并稀釋到刻度。 按照前期工作方法學(xué)考察中的色譜條件［8］進(jìn)樣 10 μL。 每個(gè)樣品平行兩份， 經(jīng)測定，計(jì)算生物堿提取率。 小檗堿及總生物堿的提取率見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在 pH4.0 時(shí)， 小檗堿、 總生物堿的提取得率均達(dá)到最高。

圖1 酶解 PH的考察

2.2.3 酶解時(shí)間考察 稱取 10 g黃連 9 份， 置于 100 mL三角瓶中， 分別加入 8 倍量 pH4.0 的硫酸水， 纖維素酶用量均為黃連藥材質(zhì)量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中分別酶解1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 h 后， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見圖 2。 結(jié)果表明黃連加入纖維素酶酶解 2.5 h， 小檗堿及總生物堿的提取得率均達(dá)到峰值。

圖2 酶解時(shí)間的考察

2.2.4 纖維素酶用量考察 分別稱取10 g黃連8 份， 置于100 mL三角瓶中， 分別加入 8 倍量的 pH4.0 的硫酸水， 加入生 藥 質(zhì) 量 0、 0.3%、 0.6%、 0.9%、 1.2%、 1.5%、1.8%、 2.1%纖維素酶， 于50 ℃水浴中酶解2.5h， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見圖 3。 結(jié)果表明， 當(dāng)纖維素酶加入量為黃連藥材質(zhì)量的 0.9%時(shí)， 小檗堿及總生物堿的提取得率達(dá)到最大值。

圖3 酶用量的考察

2.2.5 酶解溫度考察 稱取 10 g黃連 8 份， 分別置于 100 m L三角瓶中， 加入 8 倍量 pH4.0 酸水， 再加入 0.9%纖維素酶， 分別于 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65 ℃的水浴中進(jìn)行酶解 2.5 h， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見圖 4。 結(jié)果表明， 當(dāng)酶解溫度為 40 ℃時(shí)， 小檗堿及總生物堿的提取得率達(dá)到最大值。

圖4 酶解溫度的考察

2.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)選纖維素酶酶解工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果， 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) L9（34）， 選擇纖維素酶用量、 溫度、 pH、 酶解時(shí)間四個(gè)因素作為考察對象， 以小檗堿及總生物堿提取得率為評價(jià)指標(biāo)，評分時(shí)將總生物堿提取率和小檗堿提取率的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為 0.4 和0.6， 以綜合評分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 因素水平見表2， 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表3 ～4。

綜合評分 =小檗堿提取率 ×0.6+總生物堿提取率 ×0.4

表2 正交試驗(yàn)因素水平

對試驗(yàn)結(jié)果做直觀分析，由各因素的極差值 R，確定最佳提取工藝，并用方差分析評價(jià)各因素水平表對提取工藝影響的顯著性， 結(jié)果見表4。

根據(jù)直觀分析結(jié)果可知：各因素對提取金芪降糖片總生物堿的影響大小順序?yàn)椋?C＞D＞B＞A。 直接根據(jù)極差值的大小可知： 在考察的四個(gè)因素中， 酶解液的pH值影響較大，纖維素酶的用量影響較小， 并且 0.6%和 0.8%的纖維素酶對黃連生物堿的提取率比較接近， 但是選用 0.6%纖維素酶可以降低成本且不影響提取率，因此最佳酶解條件是A1B1C3D3。 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可得出以纖維素酶輔助提取金芪降糖片生物堿的最佳參數(shù)指標(biāo)分別為：加入相當(dāng)于藥材質(zhì)量 0.6%的纖維素酶， 在 pH4.5， 35 ℃條件下酶解 3.0 h。正交試驗(yàn)與單因素考察的優(yōu)選條件是一致的。方差分析表明： 酶解液的pH值、 酶解時(shí)間、 酶解溫度及纖維素酶用量對金芪降糖片生物堿提取得率的影響無顯著性差異。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 將藥材量放大 10 倍， 即稱取 100 g黃連，按照最佳工藝 A1B1C3D3下進(jìn)行纖維素酶解處理后， 在優(yōu)選的冷浸條件下進(jìn)行常規(guī)提取。并設(shè)置非酶解組與之比較，即不加纖維素酶外，其他提取過程均與酶解輔助提取法提取操作相同。 每個(gè)樣品平行3份。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表 3 L9（34） 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表 5 酶解輔助提取工藝驗(yàn)證結(jié)果 （n=3）

上述結(jié)果表明， 在 A1B1C3D3工藝條件下黃連生物堿的提取率較高， 小檗堿及總生物堿提取得率分別為 85.27%和87.54%， 與非酶解組相比， 小檗堿及總生物堿提取率分別提高了 29.98%和 30.17%， 浸膏得率降低了 25.19%。

3 討論

金芪降糖片中的生物堿主要是來源于黃連生物堿，有文獻(xiàn)報(bào)道金銀花中綠原酸可使黃連中小檗堿生成沉淀［10］，所以生產(chǎn)中采用單煎的方式提取黃連生物堿。本實(shí)驗(yàn)在單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳酶解條件下，對黃連藥材總生物堿進(jìn)行酶解輔助提取，與空白組比較，小檗堿及總生物堿提取率分別提高了約三分之一，其原因是黃連屬于根莖類藥材，其組織結(jié)構(gòu)致密堅(jiān)硬不利于有效成分的浸出，通過纖維素酶處理，細(xì)胞壁中纖維素被酶水解，減少了藥材組織細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)溶出的屏障，使其更容易擴(kuò)散被提取出來。而且通過酶處理后，其浸膏得率降低了約四分之一，也有利于降低成藥的劑量。綜上，酶輔助提取法不僅提高了金芪降糖片的內(nèi)在質(zhì)量，而且還可以縮減服用劑量，提高患者用藥的順應(yīng)性，并且該方法對設(shè)備無特殊要求，應(yīng)用常規(guī)提取儀器即可完成，更有利于在制藥工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)施。

黃連中主要含有巴馬汀、藥根堿、小檗堿等生物堿，其中前二者具有保護(hù)缺血心肌、 解毒殺菌［11］等作用， 隨著近年來對黃連研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)小檗堿具有降血糖［12］、 降血壓、 降血脂、 抗心律失常、 抗甲狀腺癌［13］等功效。也有研究表明小檗堿能通過肝細(xì)胞發(fā)揮非胰島素依賴的降血糖作用， 但不能增加胰島素的分泌［14］。 考慮到小檗堿在治療糖尿病和心腦血管疾病的作用價(jià)值，所以本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選金芪降糖片中生物堿的提取條件時(shí)，以小檗堿量為主要考察指標(biāo)，同時(shí)兼顧其他生物堿的量，篩選生物酶解輔助提取金芪降糖片中小檗堿以及總生物堿的工藝，為金芪降糖片的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）01-0192-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.050

2013-01-12

天津市科技攻關(guān)項(xiàng)目 （06YFGPSH02900）

南 楠 （1988—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 天然藥物化學(xué)。 Tel： 13102128508 ， E-mail： nan198829@126.com

*通信作者： 周 晶 （1956—） ， 女， 教授， 研究方向： 中藥及中藥制劑提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。 Tel： 13920680193， E-mail： zhoujing @tijmu.edu.cn