甘西鼠尾草中丹參二醇B抑制血管新生活性研究

莊文婷， 朱路平， 向 誠， 何 靜， 李 鵬， 李寶才*

（1.昆明理工大學 生命科學與技術學院， 云南 昆明 650500； 2.澳門大學 中華醫藥研究院 中藥質量研究國家重點實驗室， 澳門 000856）

甘西鼠尾草中丹參二醇B抑制血管新生活性研究

莊文婷1， 朱路平1， 向 誠1， 何 靜1， 李 鵬2*， 李寶才1*

（1.昆明理工大學 生命科學與技術學院， 云南 昆明 650500； 2.澳門大學 中華醫藥研究院 中藥質量研究國家重點實驗室， 澳門 000856）

目 的 研究 丹 參二醇 B的抑制 血 管新生活 性 。 方法 采用硅膠 柱 色譜和 Sephadex LH-20 柱 色 譜等分離 手 段 從甘西鼠尾草丙酮提取物中分離得到丹參二醇 B, 并通過人臍靜脈內皮細胞的生長、 遷移及其促血管生長因子的測定實驗來評價丹參二醇B的體外抑制血管新生作用,以雞胚尿囊膜為體內模型對丹參二醇B抑制血管新生活性進行研究。結果 丹參二醇B對人臍靜脈內皮細胞的生長、遷移及其促血管生長因子的分泌、雞胚尿囊膜血管生成都呈現出劑量依賴型的抑制作用。結論 丹參二醇B具有抑制血管新生活性,可作為潛在的血管新生抑制劑得以開發和應用。

甘西鼠尾草； 丹參二醇B； 內皮細胞； 雞胚尿囊膜

血管新生是指從已有血管發芽生成新的血管,它是體內一個重要的生理和病理過程,正常情況下,其促進和抑制處于一個動態平衡狀態,只發生在胚胎形成、傷口愈合以及婦女生理周期等幾個過程［1］。然而, 一 旦 這 種 平 衡 被 打 破, 就 會 伴 隨 很多疾病的出現以及免疫系統的紊亂。尤其是當體內存在的血管新生促進因子超過了血管新生抑制因子,平衡就會偏向于新血管的生成,從而可能導致癌癥、風濕性關節炎、糖尿病性失明、系統性紅斑狼瘡等嚴重 疾 病 的 發 生［2］。 因 此, 從 天 然 植 物 或草藥中去尋找具有血管新生抑制功能的活性低分子化合物成為新藥研究的一大熱點。

丹參二醇 B(tanshindiol B) 為唇形科鼠尾草屬弧隔鼠 尾 草 亞 屬 植 物 甘 西 鼠 尾 草 Salvia przewalskii Maxim中分離得到的二萜醌類化合物, 其具有抗腫瘤 (A549、 SK-OV-3、 SK-MEL-2、XF498 和 HCT-15)［3］, 抗人型結核分支桿菌和缺血后心肌收縮恢復作用［4］, 其是否具有抗血管新生活性, 尚未見報道,為此對其進行了初步的藥效學研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥材 甘西鼠尾草藥材于 2010 年 8 月采自云南省麗江市,由云南省中醫中藥研究院郭世民研究員鑒定為唇形科植物甘西鼠尾草。樣本現存于昆明理工大學生命科學與技術學院天然產物制藥實驗室。

1.1.2 細 胞 株 及 雞 胚 人 臍 靜 脈 內 皮 細 胞 株(HUVEC) 購 自 于 ScienCell Research Laboratories,試驗用雞胚購于昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司。

1.1.3 試驗儀器 BRUKER AM-400MHz超導核磁共振儀； AutoSpec Premier P776 雙 聚 焦 三 扇 型 磁 質譜儀； Agilent1200 高效液相色譜儀； Sephadex LH-20(20 ～ 100 μm,Pharmacia Fine Chemical Co., Ltd.)； MCI gel CHP20P(75 ～ 150 μm,Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)； Rp-18(40 ～ 50 μm, Merk Co.,Ltd)； 柱 層 析 硅 膠 (200 ～ 300 目)、薄層層析硅膠 (GF254) 均為青島海洋化工廠產品； 酶標儀 (Corona Co.Ltd,Ibaraki,Janpan)； 移液槍 (SelectPette) 、 CO2培 養 箱 (Thermo)、 倒 置顯微鏡 (江南)、 96 孔板、 6 孔板。

1.1.4 試驗試藥 84 消毒液、 新潔爾滅消毒液、75%乙醇消毒液、 生理鹽水、地塞米松注射液(云南白藥集團)、 PBS 緩沖液、 甲醇 (分析純)、丙酮 (分析純)、 ECM1001 培養基 ( 購自 ScienCell Research Laboratories)、 heat-inactivated FCS(購 自GIBCO公司)、P/S( 購 自 GBICO公 司)、amphotericin-B(購自 GIBCO公司)、 heparin( 購 自 上 海浩然生物有 限公 司)、 gelatin( 購 自 Sigma公 司)、噻唑藍 (MTT)( 購自 Sigma公司)、 DMSO(購自Sigma公司)、 VEGF ELISA 試 劑 盒 ( 購 自 Invitrogen,Camarillo,CA)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 干燥甘西鼠尾草 (全草) 藥材7.3 kg, 粉碎 后 過 60 目 篩, 用 100%丙 酮 (每 次20 L) 室溫下 超 聲 提 取 3 次, 每 次 2 h, 提 取 液 減壓濃縮得粗浸膏 300 g。 所得浸膏經硅膠柱 色譜石油醚-乙酸乙酯梯度 (1 ∶0、9 ∶1、 3 ∶1、1 ∶1、3 ∶7) 洗 脫,TLC檢 測 合 并 得 5 個 部 分 Fr.1 ～Fr.5。 Fr.3(52 g) 經 MCI柱 層 析 MeOH-H2O (65%、 75%、 85%) 梯度洗脫,75%MeOH-H2O洗脫部分經硅膠柱層析, 石油醚-乙酸乙酯梯度(10 ∶1、5 ∶1、2 ∶1) 洗脫, 其中石油醚-乙酸乙酯 (10 ∶1) 洗脫液中有紅色針狀結晶析出, 吸除母液, 將所 得紅 色 結 晶 經 Sephadex LH-20 柱 色 譜純化得到單體化合物 32 mg。

1.2.2 細胞培養 人臍帶靜脈細胞 (HUVEC) 培養基采用添加了 10% 胎牛血清 (FCS),1% 內皮細胞生長因子 (ECGS),1% 肝素鈉,1%P/S 的ECM1001 培養 基, 將人臍靜 脈 內 皮細胞放置 于37 ℃,5%CO2的培養箱中進行常規培養, 隔天更換培養基, 細胞密度長至 70%后每天更換培養基直至細胞密度長至 90%, 進行傳代操作, 確保細胞處于良好生長狀態。

1.2.3 噻唑藍 (MTT) 實驗 取對數期生長的HUVEC細胞, 制成一定濃度的細胞懸液, 以每孔3 000 個細胞的密度, 將細胞接種于 96 孔板中, 將96 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養箱中進行常規培養24 h,24 h 后觀察 細 胞生長狀態, 細胞生長正常的情況下, 將 96 孔板上的細胞分組, 每組 8 個復 孔, 將 含 有 不 同 質 量 濃 度 (0.5、 1.0、 2.5、5.0、10.0 μg/mL) 丹 參二醇 B( 丹參二醇 B用DMSO配制, 加入細胞培養基中的 DMSO終濃度小于 0.1%) 的培養基 180 μL加入各實驗組細胞中,以地塞米松 (5.0 μg/mL) 作為陽性對照, 空白對照組中每孔加入等量常規培養基。 給藥后在37℃, 5%CO2的培養箱中繼續進行常規培養72 h, 然后每 孔 加 入 10 μL MTT(5 mg/m L),37 ℃,5% CO2的培養箱中孵育 4 h 后, 將 96 孔 板 中 的 上 清液小心移除, 每孔加入 150 μLDMSO, 振蕩 10min后, 在酶標儀 490 nm下讀取吸光度。

1.2.4 細胞遷移實驗 取對數期生長的人臍靜脈內皮細胞,制成一定密度的細胞懸液,以每孔5.5 ×105個細胞的密度將 HUVEC細胞接種于 6 孔板中, 將 6 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養箱中進行常規 培 養24 h,24 h 后觀察細胞 生 長情況, 待細胞在6孔板底部生長形成一層無間隙的單細胞層時, 將上清液完全移除, 用 PBS 清洗細胞表面兩次, 用200 μL的槍頭在細胞層上豎直劃一道痕,顯微鏡下拍照, 加入含有質量濃度為 5.0 μg/mL丹參二醇 B的 培 養 基 2.5 m L, 空 白 對 照 組 中 每 孔加入等量常規培養基。將 6孔板置于 37 ℃,5% CO2的培養箱中進行常規培養24 h, 完全移除上清液, 顯微 鏡 下 拍 照。 用 Image Pro Plus(IPP,version5.1,Media Cybernetics) 圖 像 分 析 軟 件 對 給 藥前后的照片進行圖像分析,進行后續數據處理。

1.2.5 酶聯免疫吸附劑測定 (ELISA) 實驗 通過 ELISA實驗, 檢測 HUVEC細胞培養基中血管內皮生長因子 (VEGF) 的密度, 取對數期生長的HUVEC細胞, 制成一定密度的細胞懸液, 以每孔2.0 ×105個細胞的密度將 HUVEC細胞接種于 6 孔板中, 將 6 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養箱中進行常規培養24 h, 細胞生長正常的情況下, 移除培養 基, 加 入 含 有 質 量 濃 度 分 別 為 2.5、 5.0、10.0 μg/mL丹參二醇 B的 培養基 2.5 mL, 以地塞米松 (1 mg/m L) 作 為 陽性對照, 空 白對照組 中 每孔加入等量常規培養基, 然后將6孔板置于37 ℃, 5%CO2的培養箱中進 行常規 培養 72 h, 收 集細胞培養基, 放 入離心機中 離 心 1 min(1 000 r/min),收集上清液, 用人 VEGF酶聯免疫試劑盒對細胞培養基中的 VEGF進行定量分析。

1.2.6 雞胚尿囊膜實驗 采用雞胚尿囊膜做為體內模型來測試丹參二醇B對血管新生的影響。取新鮮種雞蛋在溫度為 37.8 ℃,5%CO2, 濕度適宜的條件下 孵 育 7 d, 在 氣室 端 開 窗 (1 cm×1 cm),用直徑為6 mm的無菌濾紙片作為給藥載體,實驗組在濾紙片上滴加用無水乙醇將丹參二醇B配制成 5.0、 10.0 mg/L兩種質量濃度的藥液各 20 μL,在超凈臺中將無水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在無菌濾紙片上滴加20 μL生理鹽水。空白組在濾紙片上加 20 μL無水乙醇, 在超凈臺中將無水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在無菌濾紙片上滴加20 μL生理鹽水。 陽性對照藥組 (地塞米松組)在濾紙片上加20 μL無水乙醇, 在超凈臺中將無水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在濾紙片上滴加20 μL地塞米松。 每組用 8 只雞胚, 完成給藥操作后,用無菌透明膠帶封窗,在上述條件下繼續孵育72 h, 向給藥部位滴加固定液 (甲醇-丙酮 =1 ∶1)對血管做固定處理 15 min, 取下尿囊膜組織, 對尿囊膜組織表面血管用數碼相機微距拍照, 用 Image Pro Plus(IPP,version 5.1,Media Cybernetics) 圖像分析軟件對圖片中血管面積進行計算［5］。

1.2.7 數據處理 CAM血管面積計數通過 IPP軟件計算得到,根據血管顏色與尿囊膜組織顏色的區別, 利用 IPP軟件濾鏡處理技術, 增強顏色對比,通過采集圖像上的不同色彩點數來計算得到血管面積； 得到的血管面積數據用 SPSS 數據處理軟件處理, 得到t檢驗數據。

2 結果與分析

2.1 化 合 物結構鑒定 根據化合 物 的 理 化 性質、1H-NMR、13C-NMR以 及 質 譜 數 據, 對 照 文 獻［6］, 鑒定化合物為丹參二醇 B, 其化學結構如圖1所示。

圖1 丹參二醇B的結構Fig.1 Chem ical structu re of tanshindiol B

丹參 二 醇 B 紅 色 粉 末 ( 吡 啶),C18H16O5, ESI-MS m/z:313 ［ M+H］+；1H-NMR(400 MHz, C5D5N) δ:2.14(2H,m,H-1),3.35(2H,m,H-2),3.98(1H,dd,J=4.4,2.9 Hz,H-3),8.03 (1H,d,J=8 Hz,H-6),7.66(1H,d,J=8 Hz, H-7),7.44(1H,s,H-16),1.50(3H,s,Me-17), 2.27(3H,s,Me-18)；13C-NMR(100 MHz, C5D5N) δ:28.5(C-1),28.1(C-2),73.8(C-3), 74.3(C-4),142.3(C-5),133.9(C-6),121.1 (C-7),128.7(C-8),126.5(C-9),150.1(C-10),183.4(C-11),175.9(C-12),120.9(C-13), 161.3(C-14),120.6(C-15),142.2(C-16),8.86 (C-17),25.5(C-18)。

2.2 噻唑藍 （MTT） 實驗結果 MTT實驗結果顯示, 丹參二醇B在一定質量濃度下具有抑制HUVEC細胞增殖的活性,如圖2所示,丹參二醇B質量濃度為 0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10.0 μg/mL時,HUVEC細胞 的 增 殖 抑 制 率 分 別 為 -2.01%、 6.01%、17.10%、 63.77%、 83.4%, 陽性組細胞增殖抑制率為 58.09%, 實驗結果顯示當丹參二醇 B質量濃度為 5.0 μg/mL時, 其抑制細胞增殖效果與陽性藥效果相近, 說明丹參二醇 B有抑制 HUVEC增殖的作用。

圖2 不同質量濃度的丹參二醇 B對 HUVEC增殖抑制率影響Fig.2 Affect of tanshindiol B on the proliferation inhibition ratio of HUVEC

2.3 細胞遷移實驗 實驗采用細胞劃痕的方法測試丹參二醇 B對HUVEC細胞遷移能力的影響, 丹參二醇 B質量濃度為 5.0 μg/mL, 作用 HUVEC細胞24 h后, 細胞遷移率為 (10.7 ±2.5)%, 空白組中細胞遷移率為 30.2% ±1.32%, 實驗結果顯示,丹參二醇B有明顯抑制細胞遷移的作用。

2.4 酶 聯 免 疫 吸 附 劑 測 定 （ enzyme-linked immunosorbent assay ELISA） 實 驗 HUVEC細 胞 培 養 基中 VEGF的濃度采用 ELISA的方法測定。 丹參二醇B 3 個質量濃 度 實驗組的吸 光 度 值 分 別 (0.416 ± 0.09)、 (0.230 ±0.06)、 (0.112 ±0.07), 空白組吸光度值為 (0.496 ±0.05), 陽性對照組吸光度值為 (0.225 ±0.4), 根 據 實 驗 所 得 標 準 曲 線(Y=519.1 X2-98.86 X+39.86,R2=0.996； X代表吸光度,Y代表 VEGF質量濃度), 可以計算出,丹參二醇 B給藥質量濃度分別為 2.5、 5.0、 10.0 μg/mL時, 細胞培養基中 VEGF的質量濃度分別為 886.0、 446.1、 353.3 pg/mL, 空 白 組 中 VEGF質量濃度 為 1 185.6 pg/m L, 陽 性 對 照 組 中 VEGF質量濃度為 439.6 pg/mL, 實驗結果顯示, 隨著丹參二醇B質量濃度的增加, 培養基中VEGF的質量濃度明顯下降, 當丹參二醇 B質 量濃度達到 5.0 μg/mL時, 培養基中 VEGF的質量濃度與陽性對照組培養基中 VEGF的質量濃度相當, 卻遠低于空白對照組,說明丹參二醇B在一定質量濃度下具有抑制 HUVEC細胞培養基中 VEGF的水平。 見表1。

表1 不同質量濃度的丹參二醇 B對 HUVEC分泌 VEGF的影響 （n=3，）Tab.1 Affect of tanshindiol B on the expression of VEGF on HUVEC（n=3，x±）

表1 不同質量濃度的丹參二醇 B對 HUVEC分泌 VEGF的影響 （n=3，）Tab.1 Affect of tanshindiol B on the expression of VEGF on HUVEC（n=3，x±）

注: 與空白對照組比較,*P＜0.005

組 別 質量濃度/(μg.mL-1) 吸光度值 VEGF質量濃度/(pg.mL-1)丹參二醇B 2.5 0.416 ±0.09 886.0 5.0 0.230 ±0.06 446.1*10.0 0.112 ±0.07 353.3*地塞米松 10.0 0.225 ±0.40 439.6*空白0.496 ±0.05 1185.6

2.5 雞胚尿囊膜實驗結果 采用雞胚尿囊膜實驗對丹參二醇B對體內血管新生的影響進行實驗研究, 實驗結果如圖4、 表2所示, 丹參二醇 B劑量為 100 ng/蛋時, 尿囊膜 血管生長稀疏, 血管有明顯斷裂,與空白組相比,其血管新生抑制率為67.9%, 丹參二醇 B劑量為 200 ng/蛋時, 尿囊膜血管幾乎不生長,給藥區域周邊血管稀疏,與空白組相比, 其血管新生抑制率為 72.0%, 此時, 丹參二醇B對尿囊膜血管新生的抑制作用與陽性對照藥效果相當,由此得出結論:丹參二醇B在一定劑量下可以顯著抑制雞胚尿囊膜血管新生。

3 討論

體內血管異常新生能夠導致癌癥、風濕性關節炎、糖尿病性失明、系統性紅斑狼瘡等嚴重疾病的發生,尤其與癌癥的發生有著密切的聯系,因為毛細血管在為腫瘤細胞提供必要的營養物質以及運輸腫瘤細胞 代 謝 產 物 方 面 扮 演 著 重 要 的 角 色［7-8］, 因此,血管新生抑制劑成為治療癌癥的一種新策略［9-10］。 例如, 美國 Genentech 公司歷時 10 年研發的抗癌藥物 Avanstin 就是一個血管新生抑制劑。 然而, 目前已上市的和正在進行 I-IV期臨床的血管新生抑制劑主要 是 抗 體 藥 物［11］, 抗 體 雖 然 具 有 定位準確的優點,但是必須采用靜脈注射的方式給藥,相比之下生產成本低、價格便宜、可口服的低分子藥物理所當然地應受到醫療一線的歡迎。近年來,許多學者也致力于從植物中尋找能夠調控血管新生的藥物。

圖3 丹參二醇 B對 HUVEC細胞遷移能力的影響Fig.3 A ffect of tanshindiol B on them igration ability of HUVEC

圖4 丹參二醇 B的 CAM標本Fig.4 Picture specimens of CAM with tanshindiol B

表2 丹參二醇 B對雞胚尿囊膜血管生長的抑制作用 （n= 8，）Tab.2 Inhibition of vascular grow th on CAM by tanshindiol B（n=8，）

表2 丹參二醇 B對雞胚尿囊膜血管生長的抑制作用 （n= 8，）Tab.2 Inhibition of vascular grow th on CAM by tanshindiol B（n=8，）

注: 與空白對照組比較,***P＜0.001

組 別 劑量/ (ng.蛋-1) 血管面積值 抑制率/%丹參二醇 B 100 110 ±61***67.9 200 96 ±16*** 72.0地塞米松 200 92 ±20*** 73.1空白343 ±72

本研究中丹參二醇B從甘西鼠尾草中首次分離得到, 并分別利用人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)和雞胚尿囊膜 (CAM) 兩個體外和體內模型, 對其抑制血管新生活性進行了研究,結果發現丹參二醇 B對 HUVEC的增殖、遷移以及分泌促血管生長因子 (VEGF) 的能力都有較好的抑制作用, 同時在CAM模型上也表現出一定的抑制血管新生活性,這些研究結果對其成為潛在的血管新生抑制劑,并進一步開發利用提供了一定的理論依據。但是其構效關系和作用機理還有待于做進一步深入研究,以為其成為臨床強效血管新生抑制劑提供前期基礎。

［1］ 王培利,雷 燕,陳可冀, 等.血管新生—治療心血管病的新策略［J］.中國中西醫結合雜志,2006,26(2):173-176.

［ 2 ］ 金惠銘, 李先濤.血管新生的調控［J］.中國微循環,2001, 5(2):85-88.

［ 3 ］ Shi Y R,Chong O L,Sang Uch.In vitro cytotoxicity of tanshinones from Salvia miltiorrhiza［ J］ .Planta Med,1997,63(4): 339-342.

［4］ 劉艾林,李銘源,王一濤,等.丹參藥理活性物質基礎研究現狀［J］.中國藥學雜志,2007,42(9):641-644.

［ 5 ］ Hayek A,Beattie G M,Lopez A D,et al.The use of digital image processing to quantitate angiogenesis induced by basic fibroblast growth factor and transplanted pancreatic islets［J］ .Microvasc Res,1991,41(2):203-209.

［ 6 ］ Luo H W,Wu B J,Yong Z G,et al.Pigments from Salvia miltiorrhiza［ J］ .Phytochemistry,1985,24(4):815-817.

［7］ 吳江雪,徐本玲,黃文林.血管生成抑制因子研究進展［J］.癌癥,2005,24(3):376-384.

［ 8 ］ Kamphaus G D,Colorado P C,Panka D J,et al.Canstatin,a novelmatrix-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］ .JBiol Chem,2000,275(1):1209-1215.

［ 9 ］ 顏延東, 趙啟仁.腫瘤新生血管生成抑制劑-腫瘤抑素的研究進展［J］.中華醫學研究雜志,2006,6(9):1003-1005.

［10 ］ Folkman J.New perspectives in clinicaloncology from angiogenesis research［ J］.Eur JCancer,1996,32(14):2534-2539.

［11 ］ Kiselyov A,Balakin K V,Tkachenko SE.VEGF/VEGFR signalling as a target for inhibiting angiogenesis［ J］ .Expert Opin Investig Drugs,2007,16(1):83-107.

Tanshindiol B from Salvia przewalskii inhibits angiogenic activity

ZHUANGWen-ting1, ZHU Lu-ping1, XIANG Cheng1, HE Jing1, LIPeng2*, LIBao-cai1*

(1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Scienceand Technology,Kunming 650500,China； 2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau,Macau 000856,China)

AIM To study the effect of tanshindiol B from Salvia przewalskii Maxim.on angiogenic activity. METHOD Tanshindiol Bwas isolated from acetonic extractof S.przewalskii and purified by the silica gel column and Sephadex LH-20 column chromatography.MTTmethod was employed to explore the effect of tanshindiol B on themigration and the expression of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)and tomeasure the vascularendothelial growth factor(VEGF)level.The chicken chorioallantoicmembrane(CAM)modelwas used for in vivo inhibition of angiogenic activity.RESULTS Tanshindiol B could inhibit the proliferation and migration of HUVEC,angiogenesis on CAM,and the secrete of VEGF in a dose-dependentmanner.CONCLUSION Tanshindiol B possesses the anti-angiogenic activity,so it can be a promising candidate for angiogenesis inhibitors.

Salvia przewalskii Maxim； tanshindiol B； human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)；chicken chorioallantoic membrane(CAM)

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1146-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.008

2013-04-15

國家自然科學基金資助項目 (30960042)； 云南省應用基礎研究計劃 (2009ZC047M)

莊文婷 (1988—), 女, 碩士生, 研究方向: 中藥化學成分活性研究。 Tel:(0871)65920738,E-mail:zhuangwenting617@ 163.com

*通 信作 者: 李 鵬 (1978—), 男, 助理 教授, 博士, 研 究 方 向: 中 藥 活 性 評 價 及 質 量 控 制。 Tel:15363569526,E-mail:pli1978@ hotmail.com李寶才 (1957—), 男, 教授, 博士, 研究方向: 天然產物醫藥開發。 Tel:15912531421,E-mail:baocaili@hotmail.com