齊墩果酸生物黏附膠囊的制備及其釋藥特征

牟景麗， 何 峰，2， 黃 勇，2， 劉麗君， 鄭 林，2*

（1.貴陽醫學院藥學院， 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004）

齊墩果酸生物黏附膠囊的制備及其釋藥特征

牟景麗1， 何 峰1，2， 黃 勇1，2， 劉麗君1， 鄭 林1，2*

（1.貴陽醫學院藥學院， 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004）

目的 制備齊墩果酸生物黏附膠囊并研究其釋藥特征。方法 采用單因素正交設計法,確定羥丙甲基纖維素K4M、 卡波姆 971PNF、 乳糖的用量及配比與制劑體外釋放度及黏附力的關系。 以齊墩果酸生物黏附膠囊在大鼠胃黏膜滯留率考察其生物利用度,并對其釋藥過程進行動力學方程擬合以判斷釋藥機制。結果 實驗表明羥丙甲基纖維素與卡波姆均能阻滯藥物的釋放和對胃腸組織有較大的黏附力。 生物黏附膠囊釋藥以 Higuchi方程擬合最佳, 與 Peppas方程也有較好的相關性。結論 該處方設計及制備工藝合理。其釋藥特征說明擴散和溶蝕均起作用,但擴散機制所占的比例相對較大。

齊墩果酸； 卡波姆 971PNF； 羥丙甲基纖維素 K4M； 生物黏附膠囊； 釋放度

齊墩果酸 (oleanolic acid,OA) 為五環三萜類化合物,廣泛存在于食物和植物中。齊墩果酸可以降轉氨酶,對急性肝損傷有明顯的保護作用,促進肝細胞再生,防止肝臟病變；臨床所用的齊墩果酸制劑為治療黃疸型肝炎、慢性遷移性肝炎及慢性活動性肝炎的齊墩果酸片劑和膠囊劑［1-2］。

胃腸道生物黏附制劑［3-5］是近年來研究較 多的新型給藥系統,它不僅能延長藥物制劑在胃腸道的滯留時間,還能增加藥物與吸收黏膜的接觸,改變細胞膜的流動性,增加藥物對小腸上皮細胞的穿透力。因而可以促進藥物吸收,提高生物利用度［6-7］。 齊墩果酸 為 難 溶 性 藥 物, 水 溶 性 較 低, 在胃腸道內停留時間短,也不利于藥物充分吸收。為了延長齊墩果酸在胃腸道內的停留時間,增加在體內的吸收,從而達到緩、控釋給藥,減少給藥次數的目的。因此,本研究利用生物黏附技術,將其制成生物黏附膠囊,以期增加其胃腸道內的停留時間, 提高其生物利用度［8］。

1 儀器與材料

齊墩果酸對照品 (中國食品藥品檢定研究院,純度≥98%, 批號 110709-200505)； 齊墩果酸原料藥 (長 沙 九 芝 堂 制 藥 廠, 純 度 ≥95.1%, 批 號20040306)； 羥丙甲基纖維素 (HPMC, 規格 K4M、K15M、 K100M) 和 卡 波 姆 ( 型 號 CP974PNF和CP971PNF)( 上海 Colorcon 公司)； 藥用乳糖、聚乙烯比咯烷酮 (PVP)K30(上海運宏化工輔料制劑技術有限公司)。

Prominence LC-20A型 高 效 液 相 色 譜 儀、 UV-2401PC型紫外分光光度計 (日本島津公司)；ZB-2 型崩解儀、 RC806 型智能溶出儀 (天津市天大天發科技有限公司)； 黏附力測定裝置 (自制)。

SD大鼠 ［250 g, 雌雄不限, 貴陽醫學院實驗動物中心, 批號 SCXK(黔)2002-0001］。

2 方法與結果

2.1 測定方法

2.1.1 最大波長的選擇 精密稱取齊墩果酸對照品10 mg, 并配 制 為 1 mg/mL的 甲 醇 溶 液 ；精 密 吸取 0.3 mL于 10 mL量 瓶 中, 用 0.5%十 二 烷 基 硫酸鈉 (以下簡稱 SDS) 溶液定容, 即得對照品溶液。 以 0.5%SDS 溶 液 為 空 白 對 照, 在 190 ～500 nm范圍內進行紫外掃描。 結果表明齊墩果酸在 205 nm處有最大吸收。

2.1.2 色 譜 條 件 Onyx Monolithic C18色 譜 柱(4.6 mm×100 mm)； 流 動 相 乙 腈 -0.5%乙 酸 溶液 (80 ∶20)； 體 積 流 量 1 mL/min； 檢 測 波 長205 nm, 柱溫 35 ℃, 進樣量 10 μL。

2.1.3 標準曲線的制備 精密量取標準貯備液0.01、 0.05、 0.15、 0.25、 0.25、 0.45 m L 于10 mL量瓶中, 按 “2.1.1” 項下操作, 配制成質量濃度為 1、5、 15、25、35、45 μg/mL的標準供試液,10 μL進樣。 以溶液質量濃度 (μg/mL) 為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性回歸方程:A= 30 544 978.5C-2 948.4(r=0.999 3), 線 性 范 圍為 1 ～45 μg/mL。

2.1.4 精密度考察 取 “標準曲線的制備” 項下低、中、高3個質量濃度的溶液,于高效液相色譜儀測定其吸收度 A,24 h 內重復測定 5 次, 計算日內精密度；連續測定5 d計算日間精密度,結果表明: 該方法的日內、 日間精密度 RSD＜3%(n= 5), 表明日內、 日間精密度良好, 符合要求。

2.1.5 回收率試驗 按標示量的 80%、100%、120%精密稱取齊墩果酸及其輔料的混合物, 按“2.1.1” 項下操作, 配制成適當濃度的 0.5%SDS溶液, 取續濾液 10 μL進樣, 以測得量與加入量相比較, 計算回收率及 RSD, 平均回收率在 98.6% ～100.6%之間,RSD＜3%(n=9), 符合要求。

2.1.6 穩定性試驗 精密稱取生物黏附細粉, 按“2.1.1” 項 下 操 作, 配 制 成 30 mg/m L的 0.5% SDS 溶液, 置 37 ℃水浴中, 分別在 0、 1、2、 4、6、 8、10、 12 h 取 樣,10 L進 樣 。 所 測 峰 面 積 的RSD為 1.12%(n=8), 表 明 齊 墩 果 酸 的 0.5% SDS 溶液在 12 h 內穩定。

2.2 齊墩果酸生物黏附膠囊的制備

2.2.1 制備工藝 按處方量稱取齊墩果酸原料藥及各種輔料, 過 80 目篩并充分混勻, 用含 8% PVP K30 的 95%乙 醇 溶 液 制 軟 材,20 目 篩 制 粒, 50 ℃下烘干2 h,20 目篩整粒, 裝入1 號膠囊, 即得生物黏附膠囊, 每片含齊墩果酸30 mg。

2.2.2 處方篩選與優化 采用單因素法, 保持主藥齊墩果酸用量為30 mg不變, 考察輔料包括黏附材料、骨架材料、填充劑 (乳糖) 的種類及用量對齊墩果酸生物黏附緩釋膠囊釋放度和黏附力的影響,從而確定膠囊的最優處方。且釋放度均用相似因子法進行評價［9］。

2.3 體外釋放度的測定 采用中國藥典 2010 版第二部附錄X C第一法裝置 (籃 法), 以 脫 氣 0.5%十二烷 基 硫酸鈉 (SDS) 溶 液 900 m L為 溶 出 介 質,轉 速 為 100 r/min, 溫度 37.5 ℃, 分 別 于 1、 2、 4、6、 8、10、 12 h 取 樣 5 mL, 同 時 補 充 同 溫 等 量 介質 5 mL, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 棄去初濾液,續濾液10 μL進行高效液相色譜法測定。

2.4 生物黏附 膠 囊 體 外 黏 附 力 評 價［10-13］大 鼠 黏膜組織制備: 實驗前動物禁食不禁水12 h, 取出胃和小腸,縱向剖開,用磷酸鹽緩沖液沖去內容物,將其固定于縱向切開的聚乙烯管上。

實驗裝置圖見文獻［12］ 報道。 分別選取 20 目粒徑范圍的黏附顆粒 100 粒, 均勻鋪撒在小腸或胃黏膜上。 將聚乙烯管傾斜 60℃, 置盛有飽和硝酸鉀溶液的干 燥 器 (RH=92.5%) 內, 放置 20 min,使顆粒充分水化并與小腸胃黏膜發生相互作用。然后將聚乙烯管傾斜度 45℃, 用蠕動泵控制磷酸鹽緩沖液流速由上至下進行淋洗,淋洗流速為40 mL/min, 記錄滯留于 大鼠小腸或胃黏膜 上的顆粒數,計算顆粒在腸或胃黏膜上的滯留率。

滯留率%=淋洗后顆粒數/100 ×100%

2.5 單因素考察 以輔料的型號、 用量設計各處方,并按下表各處方順序進行單因素考察,篩選出各輔料的型號和最佳用量, 各處方組成見表1。

表1 單因素考察Tab.1 Single factor exp loration

以各處方 2、 6、 12 h 的累積釋放 度 Q值及黏附力為評價指標,結果各輔料型號、用量分別為HPMC K4M 48 mg、 CP971PNF 9 mg、 乳 糖 用 量10 mg時較好。 結果如表 2 ～3 所示。

表2 單因素考察結果Tab.2 Results of single factor exp loration

表3 單因素相似因子考察結果Tab.3 Sim ilarity factor of single factor exploration

2.6 正交設計

2.6.1 因素水平的確定 根據單因素試驗結果,以 HPMC用量、 乳糖用 量、 乳 糖 用 量 為 3 因 素,各安排3水平進行正交, 見表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels of orthogonal test

2.6.2 正 交 設 計 處 理 方 法［9］為 兼 顧 各 項 指 標,采用綜合加權評分法,將兩指標轉化為單一指標。兩個單項指標的獲得方法如下:

①釋放度指標 f1按 A=(R2+R6+R12)/3計算,式中A為溶出度評價參數,凡為2 h的累百分率評價分數,2 h 累積溶出 20%計為 100 分, 每增加或減少 1%則減 2 分,6 h 累積溶 出 60%計為100 分, 每增加 或 減少 1%則減 2 分,R12為 12 h 的累積溶出百 分率的 評價分數,12 h 累積溶 出 90%計為100 分每增加 1%加2 分, 每減少 1%減 2 分。Amax為測得的最大值, 歸一化后釋放度指標為

各處方釋放度指標、黏附力指標和綜合指標計算結果見表 5, 方差分析見表 6。

表5 正交設計及結果Tab.5 Results of orthogonal test

表6 方差分析結果Tab.6 Result of ANOVA

一致性子集表結果見表7。

表7 綜合指標一致性子集Tab.7 Consistent subset table of capsu les

通過方差分析及一致性子集表分析,A、 B、C三因素中A、B因素具有顯著性差異,在所選因素范圍內,CP971PNF、 HPMCK4M、 乳糖不同用量,各因素作用主次順序為 B＞A＞C, 其最佳工藝條件為 A3B2C2。

2.7 釋藥機制的探討 按照最優處方制備 3 批齊墩果酸黏附膠囊,進行釋放度試驗。將3批生物黏附膠囊 R t的平 均 值 -t曲線 (R t-t曲線) 分別 以 零級、 一級、 Higuchi、 Peppas方 程 進 行 擬 合, 并 按Peppas方程計算釋放參數以判斷釋藥機制。 3 批齊墩果酸生物黏附膠囊的釋放度和黏附力結果如圖1、 圖 2 所示。 R t-t曲線 (見圖 1) 的零級、 一級、Higuchi以及 Peppas方程見表 8。

圖 1 3 批齊墩 果 酸 生物黏附 膠 囊的 R t-t曲線Fig.1 Curve of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches dissolution

圖2 3批齊墩果酸生物黏附膠囊的黏附力Fig.2 Adhesive force of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches

表8 擬合的釋藥方程Tab.8 Analysis of release data from bioadhesive-coated capsules using different equations

結果表明, 黏附膠囊釋放曲線用 Higuchi釋放方程擬合相關性較高,表明黏附膠囊的釋放機制以擴散為主。 經 Peppas方程擬合也有較好的相關性。根 據 Peppas方 程:Mt/M∞=knt, 即 In Mt/M∞= n lnt+Ink, 式 中 Mt/M∞為 藥物在某一 時 刻的累積釋放百分數,t為時間,k為釋放常數,n為釋放參數, 該參數是 PePpas方程中表征釋放機制的特征參數, 計算結果表明 n=0.83( ＜0.89), 表明釋放時,擴散和溶蝕均起作用,擴散機制所占的比例相對較大。

4 討論

4.1 隨著 CP971 用量的增加, 釋放度相應減少,這是因為當處方中含有較多的 CP971 時, 藥物釋放過程中形成了微凝膠團,藥物被包裹在微凝膠團中,需通過微凝膠團擴散和凝膠團的溶蝕而釋放,使得藥物在檢測的時間內完全釋放比較困難,因此釋放速 度 可 能 很 緩 慢［13］。 HPMC水 化 形 凝 膠 層,控制藥物的釋放速度。因此在方差分析中, HPMC、 CP對藥物的釋放有顯著性影響。 目標制劑中釋放度和黏附性均為重點,因此正交設計中以釋放度和黏附力結合獲得綜合指標, 以 SPSS 統計學軟件進行方差分析,得到優化處方的參數,并通過驗證獲得符合要求的制劑。

4.2 生物黏附性能的體外評價方法有測定最小剝離力、 組織留存率 Rargas法等。黏附力測試預實驗中曾采用文獻 報 道 的 黏 附 力 測 試 裝 置［11］, 發 現腸黏膜容易從薄片上脫落。本實驗對黏附力測定裝置進行改良,通過自制的沖洗槽,將膠囊顆粒均勻鋪在胃黏膜上,用很低流速沖洗黏附顆粒,計數沖洗顆粒,所用測量方法重現性良好,能用于胃腸道生物黏附制劑的處方篩選。制備的齊墩果酸生物黏附膠囊對胃腸組織有較大的黏附力［12］。

4.3 通過對不同釋藥方程的擬合, 顯示優化后的處方釋藥機制符合 Higuchi釋放, 表明生物黏附膠囊的釋放機制以溶蝕擴散為主。 同時經 Peppas方程擬合也有較好的相關性,顯示此制劑中藥物的釋放機制為擴散和骨架溶蝕的協同作用,這可能是因為在釋放初期,藥物釋放速度主要依賴于顆粒接觸介質的表面積以及顆粒周圍介質的濃度梯度而導致藥物的快速釋放［14］, 從而以擴散為主的釋放機制,隨著藥物釋放的進行,HPMC逐漸形成凝膠層, 逐開始溶蝕,藥物隨著骨架結構的溶蝕開始緩緩釋出,此時藥物的釋放機制既有架溶蝕,又有擴散。

［1］ 謝 琚,溫 明,劉建明.齊墩果酸口服自微乳在大鼠體內的藥動學研究［J］.中成藥,2012,34(2):257-260.

［2］ 劉亞妮,劉 婧,蘇玉永,等.齊墩果酸骨架緩釋片釋藥影響因素的考察［J］.醫藥導報,2009,28(4):436-438.

［3］ 江 波,印春華.提高難溶性藥物口服生物利用度的方法［J］.中國醫藥工業雜志,2002,33(7):358-361.

［ 4 ］ 劉哲鵬, 潘 俊, 陸偉躍.生物粘附微球研究及前景［J］.國外 醫 藥—合 成 藥 生 化 藥 制 劑 分 冊,2001,22(2): 111-114.

［ 5 ］ 李 飛, 劉紅寧, 朱衛豐.生物黏附制劑的研究近況［J］.中成藥,2005,27(12):1452-1454.

［6］ 翁 升,黃祖貴,耿 旦.生物黏附制劑的黏附機制及其新劑型的發展近況［ J］.海峽藥學,2008,20(7):31-33.

［7］ 魏科達,方平飛,趙緒元.胃腸道特異性生物黏附給藥系統的研 究 進 展 ［ J］.中 國 醫藥工業雜志,2010,41(1): 55-58.

［8］ 席 佳,唐海誼,鄭 穎.齊墩果酸口服制劑及其體內藥動學 研 究 進 展 ［ J］.中 國 新 藥 雜 志,2009,18(6): 507-510.

［9］ 林文慧,廖永紅,王向濤.葛根總黃酮胃腸道生物粘附制劑的研究 ［D］.社京協和醫學院.中國醫院科學院碩士學位論文,2008.

［10］ 孫 黎, 范玉玲, 喬喜芹.體外粘附力測定方法的研究［J］.黑龍江醫藥,2005,18(6):434-435.

［11］ 丁勁松, 蔣學華.生物粘附性萘哌地爾緩釋膠囊的處方篩選［J］.中國醫院藥學雜志,2002,22(7):387-390.

［12］ 史 中, 侯惠民.重組人表皮生長因子生物黏附制劑的體外黏 附力 評價［ J］ .中國新 藥雜 志,2000,31(2):82-83.

［13］ 高朝霞, 蔣學華, 張川川, 等.體外黏附力的測定及在生物黏附制劑處方篩選的試用［J］.中國醫藥工業雜志, 2006,37(9):606-608.

［14］ 鄭玲利, 張志榮, 訾鐵營, 等.鹽酸黃連素生物黏附包衣片的 制 備 及 性 質 研 究 ［ J］.中 國 藥 房,2010,21(3): 221-223.

Preparation of oleanolic acid bio-adhesive-coated capsule and their release characteristics

MU Jing-li1, HE Feng1,2, HUANG Yong1,2, LIU Li-Jun1, ZHENG Lin1,2*

(1.School of Pharmacy,Guiyang Medical College,Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM, Ministry of Education,Guiyang 550004,China； 2.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province,Guiyang 550004,China)

oleanolic acid； carbopol 971PNF； hypromellose； bioadhesive releasing rate

R944

:A

:1001-1528(2014)06-1186-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.016

2013-07-14

貴州省社會發展攻關計劃課題 (黔科合 SY ［2013］ 3057 號)； 貴陽市科技計劃項目 ( 筑科合同 ［2013204］ 4-3 號)； 貴州省中藥現代化科技產業 (黔科合中藥字 ［2011］ 5081 號)。

牟景麗 (1987—), 女, 碩士生, 從事藥物新劑型及藥代動力學研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail:chanli@126.com

*通信作者: 鄭 林 (1981—), 女, 碩士, 副教授, 從事天然藥物活性物質基礎及藥代動力學研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail: mailofzl@126.com