妊娠期糖尿病患者核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1基因多態性研究

張紅萍 馬衛德 黃凌霄 張晨暉 李建新 張月輝 鄭加永

妊娠期糖尿病患者核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1基因多態性研究

張紅萍 馬衛德 黃凌霄 張晨暉 李建新 張月輝 鄭加永

目的 了解妊娠期糖尿病（GDM）患者核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）基因位點rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044TGA和rs1799774 IVS20delT-11多態性的分布情況。方法選取94例GDM患者（GDM組）與94例健康孕婦（對照組）。采用聚合酶鏈反應-高分辨率溶解曲線（PCR-HRM）技術檢測ENPP1基因位點rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044 TGA和rs1799774 IVS20delT-11的3個基因型。樣本的群體代表性進行哈丁溫伯格遺傳平衡（HWE）檢驗；組間基因型頻率比較采用SPSS 20．0軟件進行χ2檢驗，連鎖不平衡采用SHEsis軟件進行分析。結果rs1044498的C等位基因在GDM組的頻率為68．1%高于對照組的12．2%，差異有統計學意義（P＜0．01）；CC、AC基因型攜帶者患GDM的風險分別是AA基因型攜帶者的90．46和2．339倍。rs7754561的A等位基因在GDM組的頻率為43．1%高于對照組的32．4%，差異有統計學意義（P＜0．05）；AA、AG基因型攜帶者患GDM的風險分別是GG基因型攜帶者的3．576和0．445倍。rs1799774等位基因頻率分布差異無統計學意義，-|-基因型攜帶者患GDM的風險是TT型攜帶者的3．084倍，是Tdel+TT攜帶者的3．478倍。單倍型AAT、ACdel、GAT、GCT、ACT與GDM發病正相關（OR＞1）。結論rs1044498 K121Q和rs7754561 A＞G+1044TGA位點的基因多態性與GDM有關，rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能是導致GDM發病的高危因素。

妊娠期糖尿病 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1 基因 多態性

妊娠期糖尿病（gestational diabetes，GDM）指妊娠過程中發生或首次發現的糖尿病，是圍生期常見的并發癥，發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。研究發現GDM家系中2型糖尿病或糖耐量損傷的比例較正常家系增高，GDM患者產后2型糖尿病的發生率升高，提示GDM和2型糖尿病之間有許多病理生理及生化方面的相似之處，以胰島素抵抗和胰島素分泌功能受損為特征。核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase1,ENPP1）為最近發現與胰島素抵抗及2型糖尿病相關的基因，其能水解磷酸二酯鍵和焦磷酸鍵，最終起到抑制胰島素的作用。Meyre等[3-5]發現ENPP1基因多態性與2型糖尿病有關，但ENPP1與GDM的相關性研究未見報道。故我們對溫州地區孕婦中ENPP1基因K121Q、IVS20delT-11及 A＞G+1044TGA多態性與GDM的關聯進行了研究，旨在為GDM高危人群的篩查和早期預防提供參考依據。

1 對象和方法

1.1 對象 2012-04—2013-04我院產前檢查的溫州地區188例漢族懷孕婦女，其中GDM孕婦94例（GDM組），健康孕婦（對照組）94例。GDM診斷參照2010年國際妊娠合并糖尿病研究組織（IADPSG）推薦標準：孕婦首次產前檢查時，FPG≤7.0mmol/L或隨機血糖≤11.1mmol/L；并于妊娠24～28周時，行OGTT，分別于空腹和服葡萄糖后1、2h測定血漿葡萄糖，其界限分別為5.1、10.0、8.5mmol/ L，任何1項血糖達到或超過上述標準即診斷為GDM。對照組要求FPG≤4.4 mmol/L。本研究經溫州市人民醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書，同意將其血樣用于本研究。

1.2 生理指標測定及DNA提取 產前門診記錄孕前身高、體重，計算孕前BMI，采用BD真空采血系統抽取研究對象空腹靜脈血3ml，分成2管。其中促凝管收集血液2ml，靜置30min后，3 000r/min離心10min，分離血清用于測定血糖、TC、TG、HDL-C和LDL-C；另1管用EDTA抗凝管收集血液1ml，采用天根公司DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，用超微量紫外分光光度計進行DNA濃度測定并標化至50ng/μl，置于-20℃保存備用。

1.3 基因分型 參考NCBI Reference Assembly（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得K121Q、IVS20delT-11及A＞G+1044TGA 3個SNP附近基因序列信息。使用Primer 5軟件設計SNP位點引物，引物由上海生工生物技術有限公司合成。采用高分辨率溶解曲線（HRM）法進行基因分型，Type-it HRM PCR Kit試劑由QIAGEN公司提供。擴增體系：體系總體積為10μl，其中HRM PCR Master Mix 5μl，DNA模板1μl，上下游引物個0.7μl。于Roche LightCycler480儀器擴增，條件為95℃預變性5min；95℃10s，55℃30s，45個循環；65℃1s，65～95℃每升高0.02℃采集1次數據，獲得HRM曲線。PCR-HRM技術可直接將樣本分為野生型、雜合型突變和純合型突變3種基因型，每種基因型中挑選部分樣本進行Sanger測序驗證，HRM引物序列和測序引物序列見表1。

表1 HRM引物序列和測序引物序列

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件分析相對危險度（OR）以及95%可信區間（CI），計數資料比較采用χ2檢驗。采用SHEsis軟件（http://analysis.bio-x.cn/SHEsis-Main.htm）進行連鎖不平衡分析，以P＜0.05說明存在連鎖不平衡；進行單倍型分析，定義最低頻率閾值為0.03，即頻率＜0.03的單倍型不予考慮分析；進行哈丁溫伯格遺傳平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）驗證樣本的群體代表性，以P＞0.05為符合HWE定律。

2 結果

2.1 兩組臨床資料和生化指標比較 見表2。

表2 兩組臨床資料和生化指標比較

由表2可見，GDM組年齡明顯大于對照組（P＜0.05）。GDM組FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、孕前BMI與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。GDM組OGTT實驗的1、2h血糖均較對照組高（均P＜0.01）。

2.2 HWE定律吻合度檢驗 經HWE檢驗，在對照組SNP rs1044498、rs7754561、rs1799774多態位點的基因型頻率已經達到遺傳平衡（P＞0.05），說明對照組入選人群具有群體代表性。

2.3 基因分型結果 見圖1。

圖1 ENPP1基因rs1044498、rs7754561及rs1799774基因型及測序

由圖1可見，通過HRM基因分型系統發現SNP rs1044498、rs7754561和rs1799774均有3種基因型，并且每種基因型和未知基因型均得到Sanger測序的驗證。

2.4 兩組ENPP1基因3個SNPs的等位基因和基因型分布結果的比較 見表3。

由表3可見，在等位基因中rs1044498的C等位基因在GDM組出現的頻率為68.1%，而對照組則為12.2%，有統計學差異（P＜0.01）；CC、AC基因型攜帶者患GDM的風險分別是AA基因型攜帶者的90.46（P＜0.01，OR=90.46，95%CI：20.46～399.9）和2.339倍（P＜0.05，OR=2.339，95%CI：1.015～5.388）；在顯性模型（CC+ AC、AA）分析中，C等位基因攜帶者（CC+AC）患GDM的風險是AA型攜帶者的10.73倍（P＜0.01，OR=10.73，95% CI：5.459～21.10）；在隱性模型（CC、AA+AC）分析中，CC基因型攜帶者患GDM的風險是（AA+AC）攜帶者的70.86倍（P＜0.01，OR=70.86，95%CI：16.44～305.5）。

rs7754561的A等位基因在GDM組出現的頻率為43.1%，對照組為32.4%，有統計學差異（P＜0.05）；AA、AG基因型攜帶者患GDM的風險分別是GG基因型攜帶者的3.576（P＜0.01，OR=3.576，95%CI：1.469～8.705）和0.445倍（P＜0.05，OR=0.445，95%CI：0.2272～0.8713）；在隱性模型（AA、AG+GG）分析中，AA基因型攜帶者患GDM的風險是（AG+GG）的5.039倍（P＜0.01，OR=5.039，95%CI：2.166～11.73）。

rs1799774等位基因頻率分布無統計學差異，-|-基因型攜帶者患GDM的風險是TT型攜帶者的3.084倍（P＜0.05，OR=3.084，95%CI：1.039～9.149），是Tdel+TT攜帶者的3.478倍（P＜0.05，OR=3.478，95%CI：1.229～9.843）。

2.5 SNP間連鎖不平衡分析和單倍型分析結果 見表4～5。

由表4～5可見，采用SHEsis軟件對3個SNPs進行連鎖不平衡分析和單倍型分析得出3個SNPs間不存在連鎖不平衡，單倍型分析顯示AAT（rs1044498 A，rs7754561 A，rs1799774 T）、ACdel、GAT、GCT、ACT在GDM組出現頻率高于對照組。

3 討論

研究采用回顧性病例-對照設計分析了溫州地區94例GDM患者和94例健康妊娠孕婦ENPP1基因rs1044498、rs7754561及rs1799774多態性，研究結果顯示rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能與GDM有關。臨床資料顯示年齡是GDM發生的一個高危因素，與相關報道一致[6]。GDM是內分泌代謝障礙性疾病，主要表現為糖代謝紊亂、脂代謝紊亂，有學者認為GDM患者LDL、TG異常升高，孕早期TG的升高與GDM發病風險呈正相關[7]，然而研究中未發現BMI、血脂（TC、TG、HDL-C和LDL-C）等在GDM組和對照組中存在差異。

迄今為止，糖尿病已成為臨床上的主要內分泌疾病，也成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病[8]。WHO糖尿病專家委員會提出糖尿病分為4大類，即1型糖尿病、2型糖尿病、GDM和特殊類型的糖尿病。GDM是僅次于2型糖尿病的第二常見類型糖尿病。Zhang等[9]對天津地區GDM發病率進行調查，發現從1999～2008年GDM發病率升高了2.8倍，由2.4%～6.8%。盡管人們對GDM的危害已有明確認識[10]，但其發病機制的研究相對匱乏。全基因組關聯研究（GWAS）使得研究復雜疾病的靶基因成為可能，已有多個研究小組將GWAS應用于2型糖尿病的研究，并發現了許多相關基因[8，11]。目前關于GDM的GWAS研究較為匱乏，基于GDM與2型糖尿病發病機理的相似性，研究將以2型糖尿病相關的基因做篩選點，了解其與GDM的關系。

ENPP1是一種廣泛表達的2型跨糖蛋白，屬于ENPP酶家族，具有水解核苷酸中5′磷酸二酯鍵的作用。Maddux首次發現ENPP1高表達導致胰島素受體功能受損，從而引發胰島素抵抗[12]，這一觀點也相繼被其他研究小組證實。體內實驗同樣發現肝臟和肌肉組織中ENPP1的增加伴隨著機體的胰島素抵抗和高血糖的發生[13-14]。研究同樣發現ENPP1基因的突變導致糖耐量受損及2型糖尿病的發生[3，15]，如K121Q、IVS20delT-11、A＞G+ 1044TGA單核苷酸多態性。rs1044498 K121Q多態性位于ENPP1基因第4號外顯子上，Q121和K121兩個等位基因都可以直接作用于胰島素受體，但突變型Q121比野生型K121更強地抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性，從而抑制胰島素作用。rs1799774 IVS20delT-11和rs7754561 A＞G+1044TGA屬于非編碼多態性，分別位于內含子和3′非編碼區，其所起的功能未知，或許與基因表達的調控有關。研究是首次對rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044TGA和rs1799774 IVS20delT-11多態性與GDM的關系進行闡述，發現rs1044498 K121Q和rs7754561 A＞G+1044TGA位點基因多態性與GDM有關，提示rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能是GDM發病的高危因素。

表3 兩組ENPP1基因3個SNPs的等位基因和基因型分布結果的比較

表4 3個SNPs間連鎖不平衡分析

表5 GDM和對照組單倍型關聯分析[例（%）]

[1]Landon M B．Gestational Diabetes[J]．Clin Obstet Gynecol,2013, 56：757．

[2]Wang Y,Nie M,Li W,et al．Association of six single nucleotide polymorphisms with gestational diabetes mellitus in a Chinese population[J]．PloS one,2011,6：e26953．

[3]Meyre D,Bouatia-Naji N,Tounian A,et al．Variants of ENPP1 are associated with childhood and adult obesity and increase the risk of glucose intolerance and type 2 diabetes[J]．Nature genetics, 2005,37：863-867．

[4]Zhao T,Liu Z,Zhang D,et al．The ENPP1 K121Q polymorphism is not associated with type 2 diabetes or obesity in the Chinese Han population[J]．Journal of human genetics,2011,56：12-16．

[5]McAteer J B,Prudente S,Bacci S,et al．The ENPP1 K121Q polymorphism is associated with type 2 diabetes in European populations：evidence from an updated meta-analysis in 42,042 subjects[J]．Diabetes,2008,57：1125-1130．

[6]Rebecca voelker．Infant birth weight,gestational age affect maternal diabetes risk[J]．JAMA：the journal of the American Medical Association,2013,310：2032．

[7]鄭媛媛,翟桂榮．妊娠早期脂代謝異常對妊娠糖尿病的影響[J]．北京醫學,2013,35(10)：821-823．

[8]Scott L J,Mohlke K L,Bonnycastle L L,et al．A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants[J]．Science,2007,316：1341-1345．

[9]Zhang F,Dong L,Zhang C P,et al．Increasing prevalence of gestational diabetes mellitus in Chinese women from 1999 to 2008[J]．Diabetic medicine：a journal of the British Diabetic Association, 2011,28：652-657．

[10]Hartling L,Dryden D M,Guthrie A,et al．Benefits and Harms of Treating Gestational Diabetes Mellitus：A Systematic Review and Meta-analysis for the US Preventive Services Task Force and the National Institutes of Health Office of Medical Applications of Research[J]．Ann Intern Med,2013,159：123-151．

[11]Sladek R,Rocheleau G,Rung J,et al．A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes[J]．Nature, 2007,445：881-885．

[12]Maddux B A,Sbraccia P,Kumakura S,et al．Membrane glycoprotein PC-1 and insulin resistance in non-insulin-dependent diabetes mellitus[J]．Nature,1995,373：448-451．

[13]Di Paola R,Caporarello N,Marucci A,et al．ENPP1 Affects Insulin Action and Secretion：Evidences from In Vitro Studies[J]．PLoS One,2011,6：9．

[14]Maranghi M,Prudente S,D'Erasmo L,et al．The ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1(ENPP1)K121Q polymorphism modulates the beneficial effect of weight loss on fasting glucose in non-diabetic individuals[J]．Nutr Metab Carbiovasc Dis,2013,23：505-510．

[15]Bacci S,De Cosmo S,Prudente S,et al．ENPP1 gene,insulin resistance and related clinical outcomes[J]．Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2007,10：403-409．

（本文編輯：沈昱平）

“第三屆國際肝膽胰外科及微創外科大會”通知

由浙江省人民醫院和浙江省抗癌協會共同主辦，《中華醫學雜志》、《中華外科雜志》、《中華消化外科雜志》、《中華普通外科雜志》、《中華肝膽外科雜志》、《中國實用外科雜志》、《中國微創外科雜志》、《浙江醫學》（排名不分先后）編輯部共同協辦的第三屆國際肝膽胰外科和微創外科大會將于2014年12月12日至14日在杭州舉行。

本次大會將邀請美國、日本、新加坡、印度、香港、臺灣和中國大陸著名肝膽胰外科專家、學者、院士就肝膽胰外科發展的熱點、難點和發展趨勢進行研討。會議內容：大會學術報告、全國手術視頻總決賽和手術演示。手術演示內容：達芬奇機器人肝膽胰外科手術、腹腔鏡胰十二指腸切除術、肝膽胰腫瘤納米刀治療、復雜肝膽胰外科手術。歡迎廣大外科同道積極投稿和參會。

征文要求：肝膽胰外科、微創外科的基礎和臨床研究。形式：手術視屏（光盤，錄像格式AVI、MPEG）、文字（word）或PPT三種形式。入選優秀論文或視頻將在會上報告。注冊代表獲國家級繼續醫學教育學分5分。

征文截止日期：2014年11月15日。會議聯系人：吳嘉（電話15858256026），張宇華（電話13588033123）。征文電子版發至郵箱：inthbp@163.com或zyhemail@hotmail.com或登陸網站注冊：www.inthbp.com

本刊編輯部

Association of ENPP1 polymorphisms with gestational diabetes mellitus

Objective To investigate the association of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1(ENPP1) gene polymorphisms with the risk of gestational diabetes mellitus(GDM)．MethodsThe polymorphisms of ENPP1(rs1044498 K121Q,rs7754561 A＞G+1044TGA,rs1799774 IVS20delT-11)were genotyped by polymerase chain reaction-high resolution melt(PCR-HRM)method in 94 GDM women and 94 healthy pregnant women(control group)．Hardy-Weinberg equilibrium(HWE) test was used to evaluate the representative of the sample．Genotype frequencies between groups were compared with Chi-square test,SPSS 20．0．Linkage disequilibrium was tested using SHEsis．ResultsThe C allele of rs1044498 was significantly higher in GDM group than that in control group(0．681 vs．0．122,P＜0．01)．Compared with AA,the CC and AC genotype carriers had 90．46 and 2．339 times more susceptibility to GDM．The A allele of rs7754561 was higher in GDM group than that of control group(0．431 vs．0．324,P＜0．05）．Compared with GG,the AA and AG genotype carriers had 3．576 and 0．445 times more susceptibility to GDM．However,as for rs1799774,no significant difference was found in the distribution of the alleles between two groups,-|-genotype carriers were 3．084 times more susceptibility to GDM than TT carriers,and 3．478 times than TT+Tdel carriers．In addition,the AAT,ACdel,GAT,GCT,ACT haplotypes might contribute to susceptibility to GDM．ConclusionThe polymorphisms of ENPP1 genes rs1044498 and rs7754561 are likely to associated with GDM,the C allele of rs1044498 and A allele of rs7754561 may be risk factors for GDM．

GestationalDiabetes/ENPP1 Gene Polymorphism

2014-03-27）

浙江省醫藥衛生計劃項目（Y20080240）；浙江省自然科學基金項目(Y13H040024)；浙江省醫藥衛生科技計劃平臺骨干人才項目(2013RCB015)

325000 溫州市人民醫院婦產科

鄭加永，E-mail：wryzheng@126.com