RNA干擾技術干涉后核糖體蛋白S15a在胃癌中的表達及意義

劉勇攀 石定 王澤軍 于香

RNA干擾技術干涉后核糖體蛋白S15a在胃癌中的表達及意義

劉勇攀 石定 王澤軍 于香

目的 探討RNA干擾（RNAi）技術干涉后核糖體蛋白S15a（RPS15a）在胃癌中的表達及意義。方法選取12例胃癌患者手術切除的胃癌組織，利用RNAi干涉RPS15a基因，將小片段克隆到質粒中，分別提取質粒后轉染胃癌細胞BGC823。將未轉染、隨機小片段轉染非編碼序列、siRPS15a-1轉染、siRPS15a-2轉染的BGC823細胞分為BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組，RT-PCR法及Western blot分別檢測各組RPS15a RNA及蛋白的表達情況，流式細胞儀檢測細胞增殖的變化。結果RNAi后細胞中出現了明顯的綠色熒光，提示此轉染方式是可行的。轉染檢測結果表明，本實驗提取的RNA未受到質粒DNA的污染，可以進行表達的比較。siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RNA及蛋白表達相對灰度比值與BGC-WT組、siNC組比較，差異均有統計學意義（均P＜0．05），BGC-WT組與siNC組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。RNAi后細胞增殖速度顯著下降，多數細胞集中在G0/G1期。結論RNAi技術不僅可以下調RPS15a在胃癌中表達，而且還可以抑制胃癌細胞的增殖活性。

核糖體蛋白 S15a 胃癌 RNA干擾

胃癌是最主要的惡性腫瘤類型之一，分子生物學研究表明癌基因、抑癌基因和細胞周期控制基因的異常表達參與了胃癌的發生、發展。核糖體蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）是核糖體蛋白家族中的一員，在蛋白質的生物合成中起重要作用。近年來，越來越多的證據表明RPS15a除組成核糖體促進蛋白質的生物合成，參與細胞的增殖、分化、凋亡外，還具有獨立于蛋白質生物合成作用之外的功能，尤其是參與腫瘤的發生、發展的已引起廣泛重視，但其具體的作用機制尚不清楚。本研究應用RNA干擾（RNAi）技術對RPS15a的表達進行干涉，旨在探討該基因對胃癌發生、發展的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2006-03—06在我院接受手術治療的胃癌患者12例，男7例，女5例，年齡49～76歲，平均61.4歲。所有患者均以手術切除的癌組織及癌旁正常組織（距離癌組織約5cm）進行對照分析，組織離體后立即在液氮中速凍，并置于-70℃冰箱中保存。

1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，熒光差異顯示試劑盒購于Genhunter公司，SuperScriptⅡ反轉錄試劑盒購于Gibco公司，熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司。熒光差異顯示系統（HITACHI公司生產），STRATAGENE MX3000P熒光定量PCR儀（Eppendorf公司生產），GenspecⅢ（HITACHI公司生產）。RPS15a的定量PCR及內參所選用的引物序列由Ambion公司設計。

1.3 方法

1.3.1 cDNA的制備 以Trizol提取的方法提取胃癌組織、癌旁組織及細胞總RNA并純化，用MMLV反轉錄得到胃癌和癌旁組織以及胃癌細胞的cDNA。提取的總RNA進行凝膠電泳及Gene SpecⅢ檢測。

1.3.2 熒光定量PCR分析 利用DNAstar軟件設計用于熒光定量PCR的RPS15a基因引物，內參選用人βactin（GenBank登錄號：AK225414），檢測RPS15a基因在胃癌組織、癌旁組織中的表達差異，引物序列見表1。反應條件為94℃40s，58℃35s，72℃40s。

表1 引物序列

1.3.3 RPS15a的RNAi、分組及表達變化的檢測 將RPS15a的序列提交到Ambion公司，由專業軟件設計了2條序列（siRPS15a-1：GCA AAC GCC AGG TGC TTA TTA；siRPS15a-2：GAT GAT GAA GCA TGG TTA CAT），以隨機小片段作為參照。RNAi的小片段也由Ambion公司合成。將小片段克隆到質粒中，分別提取質粒后轉染胃癌細胞BGC823，通過熒光顯微鏡觀察共表達的綠色螢光蛋白，檢測轉染效率。將未轉染、隨機小片段轉染非編碼序列、siRPS15a-1轉染、siRPS15a-2轉染的BGC823細胞分為4組，分別為BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組，然后從其細胞中提取RNA，采用RT-PCR進行RPS15a表達變化的分析。

1.3.4 RPS15a蛋白水平的檢測 收集處理后的BGC細胞，提取總蛋白進行Western blot檢測RPS15a蛋白水平。

圖2 BGC細胞轉染干擾質粒，GFP表達檢測BGC-WT：BGC細胞未經轉染；siNC：BGC細胞轉染非編碼序列，作為陰性對照

1.3.5 RPS15a RNAi后對細胞生長的影響 收集RNAi后的RPS15a細胞，行Brdu染色及流式細胞術檢測細胞周期的變化和細胞增殖的影響。在此基礎上進行克隆形成的比較實驗，轉染的細胞在軟瓊膠的平板上生長后，對細胞進行染色了解細胞生長情況。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以表示，兩組間的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 RPS15a差異表達驗證結果 凝膠電泳結果顯示，

28S和18S條帶較為明顯，總RNA的完整性和質量較好。采用Gene SpecⅢ檢測進一步證實，A260/A280值均在1.9～2.0，結果與電泳結果一致，各項指標均達到反轉錄要求。對RPS15a基因在癌組織及相應癌旁組織中的表達量進行熒光定量分析（見圖1），發現RPS15a基因在胃癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織。

圖1 RPS15a基因在癌組織及相應癌旁組織中的表達情況（C：胃癌組織；N：癌旁正常組織）

2.2 RPS15a的RNAi情況 RNAi后細胞中出現了明顯的綠色熒光（見圖2），提示此轉染方式是可行的。對轉染細胞的RPS15a的檢測結果表明，直接以RNA進行擴增，未擴增出條帶（見圖3），表明本實驗提取的RNA未受到質粒DNA的污染，可以進行表達的比較。BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RPS15a RNA表達相對灰度比值分別為（0.71±0.11）、（0.69±0.09）、（0.37±0.05）、（0.20±0.06）；siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RNA表達相對灰度比值與BGC-WT組、siNC組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），BGC-WT組與siNC組的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。BGC-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RPS15a蛋白表達檢測情況見圖4，相對灰度比值分別為（4.11±0.15）、（3.99±0.23）、（2.31±0.35）、（2.13±0.21）；siRPS15a-1組、siRPS15a-2組蛋白表達相對灰度值與對照組的比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），BGC-WT組與siNC組的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 RT-PCR檢測BGC細胞RPS15a干擾效果。BGC-WT：BGC細胞未經轉染；siNC：BGC細胞轉染非編碼序列，作為陰性對照；siRPS15a-1、-2分別為BGC細胞RPS15a 1號和2號RNA干擾質粒；RT（-）：BGC-WTRNA未經逆轉錄。

2.3 RPS15a RNAi后對細胞生長的影響 Brdu染色結果顯示，細胞增殖速度顯著下降（圖5）。同時細胞周期的狀態分析表明，干擾后多數細胞集中在G0/G1期，也說明了細胞生長受到了抑制（圖6）。在此基礎上，細胞干擾后進行了克隆形成的比較實驗。轉染的細胞在軟瓊膠的平板上生長后，對細胞進行染色，結果發現，干擾后的細胞生長慢，克隆形成較少，克隆團也較小，而正常細胞和隨機小片段的對照組細胞生長較好，克隆形成多，并且克隆團較大（圖7）。

圖4 Western blot檢測RPS15a的表達（標注與圖3相同）

圖5 Brdu檢測BGC細胞轉染RPS15a干擾質粒48h后增值。BGC-WT：BGC細胞未經轉染；siNC：BGC細胞轉染非編碼序列，作為陰性對照；siRPS15-1、-2分別為BGC細胞轉染RPS15a 1號和2號RNA干擾質粒。*P＜0.05，siRPS15-1、-2分別為BGC-WT和siNC比較

圖6 BGC細胞轉染RPS15a干擾質粒48h后周期分布比較。BGC-WT：BGC細胞未經轉染；siNC：BGC細胞轉染非編碼序列，作為陰性對照；siRPS15-1、-2分別為BGC細胞轉染RPS15a 1號和2號RNA干擾質粒

3 討論

RNAi是多種生物體內由雙鏈RNA介導的同源mRNA降解現象，其本質是siRNA與靶向mRNA特異結合、并由RISC介導其降解，從而阻止mRNA的翻譯，導致基因沉默，具有高效性、高特異性和毒性小的特點。隨著siRNA在活體中的穩定性和轉染效率的提高以及非特異性作用的減少，其在臨床上正迅速得到廣泛應用。

圖7 BGC細胞轉染RPS15a干擾質粒2周后克隆形成能力比較。BGC-WT：BGC細胞未經轉染；siNC：BGC細胞轉染非編碼序列，作為陰性對照；siRPS15-1、-2分別為BGC細胞轉染RPS15a 1號和2號RNA干擾質粒

RPS15a是高保守的核糖體蛋白，其基因位于16p13，全長為7 369bp，閱讀框架編碼130個氨基酸，相對分子量14 300。近來有學者在研究肝癌時發現，RPS15a表達可被HBvX蛋白上調，而上調RPS15a可加速人肝癌細胞株HepG2的生長及其在裸鼠體內的成瘤能力，提示該基因參與了肝癌的發生、發展[1]。Amsterdam已證實RPS15a是斑馬魚的癌基因。XU等[2]研究發現，下調RPS15a表達可抑制人類體外肝癌細胞的生長，推測該基因可能在肝癌的發生、發展中起到突出作用。Coleman等[3]在采用雌二醇治療非雄激素依賴型前列腺癌的過程中發現，RPS15a表達下調。孟存英等[4]利用免疫組化方法研究發現，RPS15a在胃腺癌中表達高于癌旁組織，且隨著胃癌浸潤深度的增加，該基因陽性表達率也逐漸增高，提示RPS15a高表達與胃癌腫瘤細胞的侵襲和轉移能力有關。Shen等[5]發現，RPS15a可與鈣調素（CaM）結合，從而發揮其核糖體裝配和翻譯過程。CaM可能通過與Ca2+的結合，在腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移調控中發揮重要作用。

本研究發現，RPS15a在腫瘤組織中高表達，進一步證實該基因可能在細胞增殖中起重要作用。運用熒光定量PCR技術進一步驗證發現，RPS15a在胃癌組織中表達顯著高于其所對應的癌旁組織，這與既往研究結果是一致的，但其上調原因及在腫瘤形成中的地位目前尚不清楚。有學者認為RPS15a高表達可能與真核起始因子4F相互作用，導致細胞惡性轉化，從而可能在蛋白翻譯水平上介導腫瘤發生[6]。也有學者認為p53突變涉及核糖體的活性或調節功能，這也可能是RPS15a在胃癌中高表達的機制之一。

為進一步研究RPS15a基因在胃癌發生、發展中的作用，筆者針對該基因mRNA設計合成2對siRNA分子（RPS15a-1 siRNA，RPS15a-2 siRNA），轉染胃癌BGC細胞，通過RT-PCR及Western blot結果顯示，siRNA轉染后可顯著抑制RPS15a mRNA及蛋白的表達，證實了應用RNA干擾技術抑制RPS15a表達的可行性；應用Brdu檢測48h后BGC細胞增殖情況發現，轉染了siRNA的細胞較未轉染及陰性對照細胞降低，而未轉染細胞與陰性對照細胞相比無明顯差異，這說明通過RNA干擾能有效的抑制BGC細胞增殖，可見RPS15a-1 siRNA及RPS15a-2 siRNA確實能阻斷RPS15a的表達，抑制BGC細胞增殖，一方面提示RPS15a與胃癌癌的發生、發展、治療及預后有密切的關系；另一方面提示RNA干擾可用于特異性阻斷RPS15a表達，為靶向誘導胃癌細胞凋亡治療提供了實驗依據，為胃癌的基因治療提供了理論基礎。

本文結果還顯示，siRPS15a作用于胃癌BGC細胞48h后G0/G1期細胞明顯增多。腫瘤既是一類基因性疾病，也是細胞周期性疾病，幾乎所有的癌基因疾病都要涉及細胞周期機制。細胞周期有3個調控點，分別調控G0/G1、G1/S、G2/M。其中G0/G1、G1/S調控點是控制細胞周期的開始，是控制腫瘤細胞周期基因治療策略的重點，而G1-S轉換是細胞周期最重要的調控點，G1期阻滯是細胞增殖抑制的重要環節，細胞不能進入S期，DNA合成無法完成，干擾了蛋白質代謝，從而抑制了腫瘤細胞的分裂。這說明RPS15a作用BGC細胞后使細胞阻滯于G0/G1期，不能進入S期，從而使細胞增殖抑制，促使細胞停止分裂。筆者認為，RPS15a可能是通過影響胃癌細胞周期，促進細胞增殖，這與XU等[2]的研究結果也是一致的。在此基礎上，作細胞干擾后進行了平皿克隆形成的比較實驗，結果發現干擾后的細胞生長慢，克隆形成較少，克隆團也較小，而正常細胞和隨機小片段的陰性對照細胞生長較好，克隆形成多，并且克隆團較大。這些結果也同樣表明siRNA可明顯抑制BGC細胞生長和繁殖。

綜上所述，運用RNAi技術干擾RPS15a基因不僅可以下調胃癌BGC細胞其表達，而且還可以抑制胃癌BGC細胞的生長增殖活性。RPS15a基因是否能夠作為一個關鍵點從而被用于腫瘤的分子靶向治療，還有待于基礎和臨床的進一步研究。同時，該基因的下調是否會影響正常細胞的功能，也有待于進一步分析。

[1]Lian Z,Liu J,Li L,et al．Human S15a expression is upregulatedby hepatitis B virus X protein[J]．Mol Carcinog,2004,40(1)：34-46．

[2]Xu M,Wang Y,Chen L,et al．Down-regulation of ribosomal protein S15A mRNA with a short hairpin RNA inhibits human hepatic cancer cell growth in vitro[J]．Gene,2014,536(1)：84-9．

[3]Coleman I M,Kiefery J A,Browny L G,et al．Inhibition of androgen-independent prostate cancer by estrogenic compounds is associated with increased expression of immune-related genes [J]．Neoplasia,2006,8(10)：862-878．

[4] 孟存英,袁東紅,王映梅,等．人核糖體蛋白S15a在胃腺癌中的表達[J]．細胞與分子免疫學雜志,2007,23(10)：937-939．

[5]Shen X,Valencia CA,SzostakJ W,et al．Scanning the human proteome for calmodulin-binding proteins[J]．PNAS,2005,102(17)：5969-5974．

[6]Davide R,Pier P P．Dose the ribosom translate cancer[J]?Cancer, 2003,3(3)：179-192．

Knock-down of RPS15a by siRNA inhibits proliferation of gastric cancer BGC823 cells

Objective To investigate the effects of ribosomal protein S15a (RPS15a)in proliferation of gastric cancer cell BGC823 by RNA interference technique．MethodsBGC823 cells were transfected with random non-coding sequences(siNC group),siRPS15a-1(siRPS15a-1 group)or siRPS15a-2(siRPS15a-2 group),respectively．RPS15a RNA and protein expression was detected by RT-PCR and Western Blot test,respectively;and the cell proliferation was determined by flow cytometry．ResultsThe expression levels of RPS15 in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups were significantly lower than those in non-transfected BGC823 cells (WT group)and siNC group (all P＜0．05);no significant differences was found between WT and siNC groups (P＞0．05)．Cell proliferation rate were decreased significantly in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups,and most cells were in G0/G1 phase．ConclusionRPS15a RNA interference technique inhibits cells growth,which is associated with the knock-down of RPS15a expression in BGC823 cells．

Ribosomal protein S15a(RPS15a)Gastric cancer(GC)RNA interference(RNAi)

2013-09-29）

（本文編輯：歐陽卿）

杭州市衛生局計劃項目（2009B049）

311100 余杭區第一人民醫院消化內科（劉勇攀、石定、于香）；余杭區第五人民醫院（王澤軍）

石定，E-mail：shidingyuhang@163.com