脂氧素A4受體ALXR在子宮內膜異位癥患者在位及異位子宮內膜組織中的表達及意義

王建芳 范偉榮 劉杰 伊碧霞 章根琴

脂氧素A4受體ALXR在子宮內膜異位癥患者在位及異位子宮內膜組織中的表達及意義

王建芳 范偉榮 劉杰 伊碧霞 章根琴

目的 探討脂氧素A4受體ALXR在子宮內膜異位癥（EMs）患者在位及異位內膜組織中的表達水平及其臨床意義。方法因EMs行腹腔鏡手術治療的患者27例，留取在位子宮內膜組織（EMs在位內膜組）和異位子宮內膜組織（EMs異位內膜組），取同期因良性卵巢囊腫行腹腔鏡手術治療患者30例為對照組，留取宮腔內正常內膜組織。分別采用實時熒光定量PCR技術、免疫組化法檢測各組內膜組織中ALXR mRNA及蛋白表達水平。結果EMs異位內膜組ALXR mRNA表達水平為0.069±0.020，EMs在位內膜組為0.039±0.013，對照組為0.019±0.008,EMs異位和在位內膜組的表達水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），EMs異位內膜組又高于在位內膜組（P＜0.05）。EMs異位和在位內膜組ALXR蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。結論ALXR mRNA及蛋白在EMs異位及在位內膜組織中均呈高表達狀態，推測ALXR可能與EMs發病有關。

子宮內膜異位癥 脂氧素A4 脂氧素A4受體ALXR 炎癥

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）即具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆黏膜以外的身體其它部位，是育齡婦女的常見病、難治病，其主要以不孕、慢性疼痛及粘連形成為特征，嚴重影響著患者的健康和生活質量。目前其發病機制仍尚不清楚，但作為一種炎癥性相關疾病的觀點已得到廣泛支持。脂氧素A4（lipoxins A4，LXA4）作為炎癥反應的內在“剎車信號”，通過與其受體ALXR結合而發揮廣泛強效的促炎癥消退效應。最近研究發現LXA4與EMs有關[1]。本研究檢測了EMs患者在位、異位子宮內膜以及正常子宮內膜中ALXR mRNA及蛋白表達水平，探討ALXR在EMs的表達水平及其意義，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2012-02—09本科行腹腔鏡手術治療的患者為研究對象。入選標準：（1）患者年齡20～40歲；

（2）具有相對規則的月經周期；（3）術前3個月未使用過內分泌藥物，6個月內無妊娠及哺乳史、刮宮手術史；（4）既往無EMs病史；（5）術前無圍絕經期癥狀者；（6）組織學診斷排除惡性腫瘤。根據內膜組織的來源分為3組：（1）EMs異位內膜組（27例）：手術病理證實為EMs，術中取典型異位內膜組織（腹腔、盆壁及卵巢異位灶）。（2）EMs在位內膜組（27例）：以上患者同時負壓刮取宮腔內膜組織。（3）對照組（30例）：因良性卵巢囊腫行手術治療的患者，不合并EMs或子宮腺肌癥，負壓刮宮方法留取宮腔內膜組織，術后病理證實為正常子宮內膜?；颊吣挲g20～40（29.4±0.2）歲；對照組年齡20～40（30.3± 0.4）歲≥兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會批準，并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR技術檢測內膜組織中ALXR mRNA的表達水平 用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。按照Genbank中人ALXR、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydephosphate dehdrogenase，GAPDH）(內參照)基因序列，利用Primer5.0軟件設計引物，引物由杭州赫貝科技有限公司合成。ALXR引物正義鏈：5＇-GCCATCTGCTATGGGCTCAT-3＇，反義鏈5＇-CGTAAGGGACGGCTGGATTT-3＇，擴增片段為91 bp。內參照為GAPDH，正義鏈為5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇， 反 義 鏈 為 5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3＇，擴增片段為258 bp。采用全自動熒光定量PCR儀（CFX connect Real-Time PCR System）進行反應。20μl反應體系中實時熒光定量PCR反應預混液（2×）10.0μl，上下游引物各0.4μl，cDNA 2.0μl（終濃度為0.2μmol/L）。95.0°C預變性3min，95.0°C變性10s，61.0°C退火/延伸20s，共40個循環。熔解曲線條件為：從70～95°C，每10s上升0.5°C。擴增產物進行熔解曲線分析和測序以確定產物的特異性，產物測序由杭州赫貝科技有限公司完成。PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager進行自動分析并計算結果。循環閾值（threshold cycle，Ct）與mRNA PCR初始表達量呈負相關?！鰿t值代表目的基因相對于內參照基因的表達量。先將不同組別的△Ct值樣本均數用SPSS13.0統計軟件進行分析，若差異有統計學意義（P＜0.05），再用2-ΔΔCt公式進行相對定量。

1.2.2 免疫組化SP法檢測內膜組織中ALXR蛋白定位表達 標本用10%甲醛溶液固定，脫水，常規石蠟包埋。蠟塊切片（4μm）后，脫蠟至水。滴加體積分數3% H2O2溶液，室溫下孵育10min。用微波進行抗原熱修復。滴加1∶100稀釋的一抗（美國novus公司）,37°C孵育2h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2min×3次。二氨基聯苯胺（DAB）染色，蘇木素復染，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察，背景為紫藍色，陽性表達在胞質，呈棕褐色。高倍視野下隨機拍5個視野（×200），并用病理圖像分析軟件（IPP）進行蛋白半定量分析，計算平均光密度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件,測得計量資料均以表示，進行方差齊性及正態性檢驗，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 ALXR mRNA在在位子宮內膜、異位子宮內膜和正常子宮內膜的表達。

2.1.1 實時熒光定量RT-PCR法檢測ALXR mRNA通過熔解曲線驗證擴增產物 結果顯示為單峰,表明產物具有特異性，見圖1-2。

圖1GAPDH熔解曲線

圖2 ALXR熔解曲線

2.1.2 各內膜組織中ALXRmRNA的表達水平比較 ALXRmRNA在異位子宮內膜的表達水平為0.069±0.020，在位子宮內膜組中的表達水平為0.039±0.013，明顯高于對照組的0.019±0.008，差異有統計學意義（t=12.328、6.943，均P＜0.05），并且異位子宮內膜中ALXR mRNA的表達水平高于在位子宮內膜中的表達水平，差異也有統計學意義（t=-6.303，P＜0.05）。

2.2 各組內膜組織中ALXR蛋白定位及半定量表達水平比較 AXLR蛋白在子宮內膜的間質細胞及腺細胞中均有表達，其定位于細胞質，呈棕黃色。AXLR蛋白在各組間的表達及定位見圖3。AXLR在異位子宮內膜和在位子宮內膜中相對表達量為分別為0.045±0.011、0.023±0.013，均高于對照組的0.008±0.003，差異均有統計學意義（t=9.079、6.528，均P＜0.05）。

圖3 ALXR蛋白在不同子宮內膜的表達（A：EMs異位子宮內膜細胞中有大量ALXR蛋白表達，SP法，×400；B：EMs在位子宮內膜細胞中有中量ALXR蛋白表達，SP法，×400；C：對照組內膜細胞中無明顯AXLR蛋白表達，SP法，×400）

3 討論

目前，ALXR在EMs中的研究非常有限，Motohashi等[1]曾報道過ALXR在EMs患者異位內膜組織中的mRNA水平高于正常人子宮內膜組織。本研究結果與Motohashi等的研究結論一致。本研究發現EMs患者異位子宮內膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平顯著高于正常子宮內膜組織，并且EMs患者異位子宮內膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平高于EMs患者在位子宮內膜。

LXA4作為一類新型的內源性脂質抗炎消退介質，通過與其受體ALXR發揮抗炎、促炎癥消退的雙重作用，被認為是內源性的炎癥“剎車信號”，可以協調急性炎癥到慢性炎癥的轉化，以達到控制炎癥，削弱慢性炎癥的趨勢。1992年，Fiore等在人中性白細胞中首次發現一種與LXA4高親和性的特異G-白偶聯受體；隨后這種G-蛋白偶聯受體被鑒定為ALXR（FPRL-1）。人類的ALXR屬于G-蛋白偶聯受體家族，包括FPRI、FPRL-1/ ALXR和FPR3三個成員，在中性白細胞、單核細胞、活化的T細胞等免疫細胞以及在腸上皮細胞、滑膜成纖維細胞、支氣管上皮細胞、腎小球系膜細胞等固有細胞中均有表達[2]。研究發現LXA4可通過其受體ALXR作用于多種類型的細胞，在抗炎促炎癥消退、減輕組織侵襲、抑制血管生成以及抗增殖、抗纖維化效應等方面發揮重要作用[3-5]。另研究發現多種細胞因子可以上調ALXR的轉錄活性，提示ALXR的表達受炎性環境的調節[6]。

目前EMs發病機制尚不明確，但EMs作為一種炎癥性相關疾病的觀點已得到廣泛支持。一般認為EMs是起始于子宮內膜組織在腹腔內膜的種植，而炎性環境對于這種疾病的發展可能起著重要作用。EMs常伴隨著多種炎癥反應，患者腹腔內免疫炎癥環境的改變，促進了異位灶的生存和增長。越來越多的證據表明EMs中子內膜組織的種植具有類似于炎癥的特征。與健康的婦女相比，EMs患者腹腔內的數目和活性增加，而其分泌的一些與炎癥有關的因子如IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-a，MCP-1，MMP-9等也有明顯的上升[7-9]。這些細胞因子通過自分泌或旁分泌發揮細胞間的通訊作用，并對巨噬細胞、單核細胞、白細胞等免疫細胞產生趨化作用，和炎性細胞之間產生正反饋效應[10]，進一步增加組織侵襲、血管形成能力乃至局部性激素濃度，促進子宮內膜的異位存活，加重炎癥，引發疼痛和不孕[11]。

LXA4在EMs中的研究，目前尚處在一個起步階段，國內外相關的研究還非常有限，但是這無法掩蓋LXA4在EMs中的研究和應用前景。Motohashi等[1]首先研究了LXA4受體ALXR在雌性大鼠子宮內膜、子宮肌膜和卵巢中的表達情況，結果顯示ALXR在子宮內膜和子宮肌膜中的基因表達顯著高于在卵巢中的表達，在動情前期（proestrus）ALXR的基因表達顯著增加，而在動情期（estrus）階段開始減少。該研究還發現孕酮可使ALXR表達明顯減少，雌激素使其微量減少，而促性腺激素對其表達幾乎沒有影響。而在子宮內膜異位癥的大鼠模型中，ALXR的表達顯著高于正常對照組。Chen等[12-13]研究發現外源性脂氧素（15-epi-LXA4）可顯著抑制子宮內膜異位癥小鼠異位病灶的重量和大小，且不影響小鼠的性周期，也無明顯不良反應。研究發現15-epi-LXA4顯著降低內異癥小鼠腹腔免疫細胞中IL-1β、TNF-a的基因和蛋白表達；同時，15-epi-LXA4還可顯著降低MMP-2和MMP-9的表達和酶活性。本研究發現EMs患者異位子宮內膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平顯著高于正常子宮內膜組織，并且EMs患者異位子宮內膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平亦高于EMs患者在位子宮內膜，推測EMs患者體內子宮內膜細胞異常增殖和組織侵襲可能誘導ALXR的表達，而LXA4與ALXR介導的促炎癥消退效應能否抑制EMs的發生、發展尚有待進一步的研究。

目前，國內關于LXA4與EMs的研究尚處于起步階段，進一步的研究將有助于揭示EMs的炎癥性發病機制，并可為EMs的抗炎藥物的研制提供理論基礎。

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Expression of lipoxin A4 receptor ALXR in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis

Objective To investigate the expression of lipoxin A4 receptor(ALXR)in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis.MethodsTwenty seven patients with endometriosis underwent laparoscopic surgery in our hospital between February 2012 and September 2012,the tissue samples of eutopic and ectopic endometrium were collected; and uterine endometrium samples were also collected from 30 patients with benign ovary cysts as controls.The mRNA and protein expression of ALXR in the eutopic endometrium,ectopic endometrium of endometriosis patients and control endometrium were detected by real-time fluorescent quantitative RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.ResultsThe mRNA expression of ALXR was 0.069±0.013 in ectopic endometrium and 0.039±0.013 in eutopic endometrium of endometriosis, which were significantly higher than that of the control(0.019±0.008,P＜0.05).The mRNA expression of ALXR in the ectopic endometrium was also higher than that of eutopic endometrium of endometriosis(P＜0.05).Compared with the control,the expression of ALXR protein in eutopic and ectopic endometrium of endometriosis were increased(P＜0.05).ConclusionThe ectopic and eutopic endometrium in patients with endometriosis shows high expression of lipoxin A4 receptor mRNA and protein, which indicates that ALXR may be associated with the pathogenesis of endometriosis.

Endometriosis Lipoxin A4 Lipoxin A4 receptor ALXR Inflammation

2014-04-08）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技局資助項目（2011-3-042）

321000 金華市人民醫院婦產科

王建芳，E-mail：jefayeking@163.com