p38MAPK與ERK1/2在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

●論 著

p38MAPK與ERK1/2在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

目的 探討絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員p38MAPK、細胞外信息調節蛋白激酶（ERK1/2）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達及臨床意義。 方法 選取43例NSCLC的腫瘤組織及其癌旁正常組織作為對照。采用蛋白免疫印跡法檢測p38MAPK、ERK1/2的表達情況，分析其與臨床特征（包括性別、年齡、腫塊大小、淋巴結轉移情況、分化程度、組織類型以及病理分期）的關系，及其表達程度與預后的關系。 結果 與配對的正常肺組織比較，phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調（均P＜0．01），43例患者中37例phospho-p38MAPK的表達平均增長2．95倍，39例phospho-ERK1/2表達平均增長3．07倍，差異均有統計學意義（均P＜0．01）。ERK1/2的表達與各臨床特征均無明顯相關（均P＞0．05），而p38MAPK的活化與腫瘤大小以及年齡相關（均P＜0．01）。ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移，p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風險回歸模型分析顯示，phospho-p38MAPK的高表達是預后不良的預測因素（P＜0．05）。 結論 p38MAPK與ERK1/2的活化表達可能在NSCLC的發生/發展過程中具有重要意義，其中p38MAPK的活化程度可輔助作為非小細胞肺癌的預后評估因素。

絲裂原活化蛋白激酶 p38MAPK ERK 非小細胞肺癌 預后

肺癌是臨床上最常見的實體腫瘤，隨著吉非替尼等 一批肺癌靶向藥物進入臨床，非小細胞肺癌尤其是腺癌患者受益，無進展生存期明顯延長。但隨之出現的耐藥現象及有限延長的總生存期促使臨床更深入探究肺癌的發生、發展機制及尋求新的分子靶點。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族廣泛分布于真核細胞中，主要有p38MAPK、C-Jun N-末端激酶/應激活化蛋白激酶（c-jun N-termina1 kinases/stress-activated protein kinase，JNK/SAPK）和細胞外信息調節蛋白激酶（extrace11u1ar signa1-regu1ated kinases 1and 2，ERK1/2）3個主要成員。MAPK通路是一條重要的聯接細胞外刺激與細胞內生物學變化的信號通路，通過MAPK通路，可以影響染色體結構以及轉錄因子的活性，從而產生一系列廣泛而重要的生物學效應，包括炎癥、細胞生長、增殖、分化、細胞周期停止、凋亡等。本研究通過檢測非小細胞肺癌（non-sma11 ce11 1ung cancer，NSCLC）患者p38MAPK、ERK1/2與JNK的表達情況，分析其與NSCLC臨床及病理特征的關系，旨在探討其表達及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2006-08-11在浙江大學醫學院附屬第一醫院手術的43例NSCLC患者的腫瘤組織標本，患者男32例，女11例，年齡37～77（62.09±8.76）歲。以離腫瘤邊緣5cm以上且病理證實無癌細胞浸潤組織為正常肺組織作為對照。腫瘤組織切下后立即放入液氮中并儲存于-79℃的低溫冰箱中。采用電話及門診方式隨訪，總生存時間定義為從手術之日至任何原因引起的死亡或者至隨訪的終點，隨訪截止時間為2012-11-30，43例患者中有5例失訪，其余38例完成了6年隨訪。

1.2 試劑與儀器 一抗1∶500～1∶1 000稀釋，抗phospho-p38MAPK抗體（Tyr-182），抗phospho-JNK1/2抗體（Thr-183、Thr-185），抗phospho-ERK1/2抗體（Thr-160、Thr-177），β-actin抗體，均購自美國SANTA CRUZ公司。二抗（1∶1 000稀釋）：驢抗小鼠以及驢抗兔的特異性二抗，購于美國SANTA CRUZ公司。垂直電泳、轉膜設備以及Ge1 Doc EQ成像分析系統均購自美國BIORAD公司。

1.3 方法 采用PBS緩沖液洗凈組織，稱取組織0.2g，剪刀剪碎后放入玻璃管，加入1m1裂解液，置于冰上，用自動勻漿機將組織細胞破碎。將裂解液回收入1.5m1 Eppendorf管中。在冰上顛倒混勻，3～5min/次，共5次，然后在4℃下12 000g離心15min，離心后留上清液，即為蛋白提取液，分裝備用。用Lowry法測定蛋白濃度，根據最低標本蛋白濃度，用PBS稀釋至相等濃度，加等量的2×樣品上樣緩沖液，在100℃沸水中煮沸5min，上樣電泳。取50μg蛋白上樣到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（100V，1.5h），并轉到PVDF膜上（300V，2h）用5%的脫脂奶粉室溫下封閉2h，一抗4℃振搖孵育過夜，二抗室溫孵育2h后用ECL顯色系統顯影，凝膠成像分析。結果用Quantity One 1-D分析軟件進行分析，軟件自動勾勒目標條帶周邊，計算選定區域內信號強度的總和，以此信號強度代表蛋白的相對表達量。以βactin作為內參，校正上樣量的誤差。

1.4 統計學處理 采用SPSS Statistic 19統計軟件，計量資料以表示，自身對照比較采用配對t檢驗。不同臨床特征者p38MAPK和ERK1/2的表達量的比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Kap1an-Meier法繪制生存曲線，p38MAPK和ERK1/2的表達與預后的關系采用Cox比例風險回歸模型進行分析。

2 結果

2.1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2的表達情況 見圖1-2。

圖1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2、phospho-JNK1/2上樣電泳圖（T：腫瘤組織，N：自身對照的正常肺組織）

由圖1可見，與配對的正常肺組織比較，phosphop38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），而JNK的表達并無明顯差異（P＞0.05）。由圖2可見，43例患者中37例 phospho-p38MAPK的表達增高，39例 phospho-ERK1/2表達增高，與配對肺組織比較，phosphop38MAPK平均增長2.95倍，phospho-ERK1/2平均增長3.07倍，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.2 p38MAPK及ERK1/2的表達與臨床特征的關系 見表1。

圖2 Quantity One 1-D軟件分析結果

由表1可見，不同臨床特征者ERK1/2表達的差異無統計學意義，而在不同年齡、腫瘤大小者之間p38MAPK表達的差異有統計學意義。

2.3 NSCLC患者生存曲線及p38MAPK和ERK1/2的表達與預后的關系 根據表達程度將p38MAPK和ERK1/2分層為未活化組（p38MAPK或ERK1/2活化表達未升高或降低）、中度磷酸活化組（活化表達升高＜2倍）及高度磷酸活化組（活化表達升高＞2倍）。3組患者生存曲線的比較見圖3。

由圖3可見，ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移，p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風險回歸模型分析顯示，phospho-p38MAPK的高表達是預后不良的預測因素（P＜0.05）。

3 討論

外界刺激作用于細胞的信號，從胞膜傳遞到胞漿及胞核，最終引起廣泛的細胞效應的途徑是一個多種細胞因子參與、逐級磷酸活化、瀑布樣放大的過程。MAPK是許多細胞膜信號傳導途徑的共同通路，通過對MAPK活性的調控，可以達到調節基因表達、有絲分裂、新陳代謝、細胞凋亡與分化等功能[1]。

表1 p38MAPK及ERK1/2的表達與臨床特征的關系

圖3 p38MAPK、ERK1/2未活化組、中度活化組及高度活化組的生存曲線

本研究結果顯示，p38MAPK和ERK1/2在NSCLC中特異性激活，且p38MAPK的活化受到腫瘤大小及患者年齡的影響。p38MAPK和ERK1/2的異常活化表達提示這兩個因子可能在NSCLC的發生及發展過程中發揮重要作用。而p38MAPK的活化與腫塊的大小之間的關系也側面印證了p38MAPK因子在腫瘤生長時的促進作用。p38MAPK的活化程度隨患者年齡增大而增加，提示在老年患者中，包括p38MAPK在內的某些致癌因子可能相對活躍。p38MAPK和ERK1/2高度活化的NSCLC患者生存曲線均下移，并有統計學意義，phospho-p38MAPK的高度活化表達是預后不良的預測因素。這些結果可能與MAPK抑制腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤轉移的作用密切相關。另外發現病理分期及低分化與預后不良可能相關，但未達到統計學意義，可能與本次研究樣本量較小相關。童向東等[2]對71例NSCLC手術標本進行了免疫組化分析，發現p38MAPK和ERK1的表達與肺癌分期有關，p38MAPK陽性表達的肺癌患者預后較差。這個研究與我們的結果有一定的一致性，提示我們p38MAPK與ERK1/2可能在總量及磷酸化活化表達兩個層面上均有提高，并推進了腫瘤的發生發展。

另外，MAPK家族的另一個重要因子JNK，在NSCLC中無明顯活化，說明不同的MAPK因子在同一腫瘤中的作用并不一致，各種因子的作用是復雜而有差異的。以往研究已經表明相同MAPK因子在不同類型腫瘤細胞中所起的作用也并不相同。研究發現，桔梗皂甙D可通過激活p38MAPK和JNK來抑制人胃癌細胞[8]，而更多的研究發現MAPK在諸如黑色素瘤[9]、胰腺癌[10]等腫瘤中發揮促進腫瘤發生的作用，這些結果提示MAPK的作用有細胞特異性，而這特異性可能來源于兩個原因：（1）MAPK各因子都有多個亞型，這些亞型有不同分布，不同表達程度，有不同的底物和各自特異性，所以它們可以在不同腫瘤中導致不同的結果。（2）MAPK有許多底物，這些底物之間作用可以不同，甚至截然相反。而不同類型和程度的刺激就可能導致不同底物的活化，從而產生不同的生物學效應。這也提示未來進一步深入的研究可以著眼于建立一個MAPK途徑效應與不同刺激之間的量效聯系。當然，MAPK活化導致的細胞效應的細胞種類特異性也應引起重視。

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Expression of phospho-MAPK in non-small cell cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo examine the expression of phospho-p38MAPK,phospho-JNK,and phospho-ERK1/2 in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance． Methods Forty-three specimens of primary non-small cell lung cancer and paired normal lung tissue were collected．The expressions of phospho-p38MAPK,phospho-ERK1/2 and phospho-JNK were detected with Western-blot analysis．The association between clinicopathological parameters and the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 protein was analyzed．Results Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 in NSCLC tissue were increased (P＜0．01)．In 37 cases,phospho-p38MAPK expression were increased by average 2．95 times(P＜0．01),while in 39 cases phospho-ERK1/2 expression were increased by 3．07 times(P＜0．01)．The expression of ERK1/2 was not correlated with clinicpathological parameters(P＞0．05)．The activation of p38MAPK was correlated with tumor size and ages of patients(both P＜0．01)．The expressions of ERK1/2 and p38MAPK were negatively correlated with survival．Multivariate analysis revealed that the expression of phospho-p38MAPK was an independent prognostic indicator for overall survival of patients (P=0．046)． Conclusion ERK1/2 and p38MAPK are activated in NSCLC,and the expression of phospho-p38MAPK can help to predict the prognosis of NSCLC．

MAPK p38MAPK ERK NSCLC Prognosis

2014-01-20）

（本文編輯：歐陽卿）

國家自然科學基金資助項目（81101768）；浙江省科技廳重大科技項目（2012C13G2010111）

310003 杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院呼吸內科（鄒俊勇現在寧波市第二醫院工作）

周建英，Email：zjyhz@zju.edu.cn