常見呼吸道病原體的實驗室檢測

陳華根，劉小花綜述，許穎審校（.四川省成都市新都區人民醫院檢驗科 60500；.成都醫學院附屬醫院檢驗科，成都 60500）

20世紀90年代世界衛生組織的統計資料表明，各種感染性疾病仍然是威脅人類健康的主要殺手，占世界人口死因的32.7%，其中呼吸道感染位居首位［1］。特別是甲型流感病毒基因變異重排，曾引起百年來數次世界范圍內流感爆發流行，死亡人數超過2000萬。從1997年香港發現首例禽流感（H5N1）患者至今，國內數省市有禽流感（H7N9）散發，死亡人數已達數百人［2－3］。2003年因冠狀病毒所致嚴重急性呼吸道綜合征，死亡1千余人［4］。因艾滋病、糖尿病和耐藥等因素影響，國內結核菌感染及肺結核患者居高不下［5］。不僅造成患者死亡，同時嚴重影響經濟發展。呼吸道病原體的實驗室檢測，可以明確感染病原體，有利于對疾病做出及時診斷、治療，制定防控策略，阻止傳播和流行。呼吸道病原體的實驗室檢測技術有多種，主要分為病原體分離培養、血清學檢測和分子生物學檢測。本文通過查閱文獻，將主要檢測技術及其在呼吸道病原體檢測中的具體應用作一概述。

1 病原體分離培養

標本來源為鼻洗液、咽漱液、咽拭子、鼻拭子、痰、血液、穿刺標本和尸檢材料等。以防污染，及時接種較好，或將標本置于冰壺內送交實驗室，選定合適的培養基或細胞組織，在2～3 h內接種培養。

痰是分離培養應用最廣泛的標本，合格的痰標本要求白細胞數大于25個／低倍視野，鱗狀上皮細胞小于10個／低倍視野，或白細胞／鱗狀上皮細胞大于2.5／1。定量培養菌量大于或等于107cfu／mL 可判定為致病菌［6－7］。細菌培養一般選用血平板、巧克力平板、中國藍／麥康凱培養基。病毒培養常選用猴腎或人胚腎細胞、二倍體細胞株、Hela、HepG2細胞、犬腎傳代細胞和雞胚接種，通過電子顯微鏡、細胞病變效應、凝血實驗、凝血抑制實驗、中和實驗和空斑形成實驗進行鑒定。

病原體分離培養是鑒別呼吸道病原體類型的金標準。特別是細菌培養不僅能鑒定病原體，而且可通過藥敏實驗選擇合適的抗菌藥物。病毒培養由于實驗條件要求較高，且操作繁瑣，在普通實驗室應用受限，多通過血清學實驗和分子生物學技術鑒定病毒。

2 血清學檢測

利用抗原抗體反應特異性原理，用已知抗原測定抗體或用已知抗體測定抗原，從而判定感染病原體類型。通常根據抗原抗體特性，偶聯不同載體或不同標記物，設計不同檢測方法。常用檢測方法有如下幾種。

2.1 凝集實驗分為直接凝集實驗和間接凝集實驗。直接凝集實驗無需偶聯載體，抗原抗體直接發生肉眼可見的凝集反應，如血型鑒定實驗和傷寒桿菌凝集實驗。間接凝集實驗利用紅細胞、明膠顆粒、膠乳及細菌等作為載體，和抗原偶聯后，與特異性抗體發生凝集反應，常根據載體名稱命名，例如紅細胞凝集實驗、明膠顆粒凝集實驗、膠乳凝集實驗等。間接凝集實驗應用多于直接凝集實驗。

2.2 中和實驗用已知抗體血清和待測病毒懸液混合，室溫下作用一段時間后接種敏感細胞，經培養后觀察細胞病變效應或紅細胞吸附現象是否消失，即特異性抗體能否中和相應病毒的感染性。

2.3 補體結合實驗補體結合實驗是一種以免疫溶血系統作為指標，檢測另一反應系統中抗原或抗體的傳統方法。具有靈敏度高、實驗條件要求低、操作簡便等優點，是一種經典的實驗方法。

2.4 固相膜免疫實驗利用硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等作為載體，金元素、硒元素和酶促底物置于載體上，抗原和抗體通過穿流或橫流的形式在載體上反應，常用的實驗方式有免疫層析實驗、免疫滲濾實驗、酶聯免疫斑點實驗、免疫印跡法等。呼吸道病原體的抗原或抗體皆可通過此方法檢測，但應用并不普遍。

2.5 酶聯免疫吸附試驗用已知的抗原（抗體）包被在聚苯乙烯微孔上，和待測的抗體（抗原）、酶標的抗原（抗體）進行反應，通過洗滌分離，繼而加入酶促底物顯色，根據呈色的強弱，判定待測物的有無或多少。該方法是臨床實驗室通過檢測抗原抗體診斷病原體感染應用最廣泛的技術，絕大多數呼吸道病原體可用酶聯免疫吸附試驗進行檢測。

2.6 熒光免疫技術（熒光抗體技術）利用熒光素（異硫氰酸熒光素）標記抗體，與載玻片上的抗原（抗體）、待測抗體（抗原）反應，洗滌分離后，用熒光顯微鏡觀察有無顯熒光的抗原抗體復合物存在。測定方式分為直接法和間接法，間接法的敏感度比直接法高5～10倍，故實驗室常采用間接法。該方法是呼吸道病原體，特別是新發高致病性病原體檢測的常用方法。如甲型流感病毒H1N1、禽流感病毒H5N1、禽流感病毒H7N9、引起嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒的檢測。由于呼吸道病原體多呈混合型感染，一次聯檢多種病原體的抗原或抗體，對于呼吸道疾病的防治具有重要意義。陳輝蘭［8］、俞小衛等［9］報道了用直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及副流感病毒1、2、3型等7種呼吸道常見病毒抗原。單詠梅等［10］、艾洪武等［11］、吉祖活等［12］報道了用間接免疫熒光法檢測呼吸道肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌、Q熱立克次體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒等9種呼吸道病原體IgM 抗體。

2.7 蛋白芯片技術將病原體蛋白（抗原或抗體）固定在微陣列上，通過一系列反應，利用芯片閱讀儀收集反應信號，從而檢測病原體。該方法可以一次檢測多種病原體，有利于快速診治呼吸道感染性疾病。楊侃等［13］報道用蛋白芯片技術檢測流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體。邢穎等［14］報道用蛋白芯片法檢測肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒。

3 分子生物學技術

從20世紀50年代Watson和Crik提出DNA 雙螺旋結構至今，分子生物學領域取得了巨大的成就。完成了生命天書“基因草圖”的繪制，使人們從基因角度明白了生命現象的本質和調控機制。蛋白組學的研究，豐富和完善了基因組學，不僅能直接解釋生命活動規律，還在疾病的診斷和防治中擁有更大的應用前景。以雜交技術和探針技術為基礎，以Mullis的聚合酶鏈反應（PCR）技術為標志的基因擴增技術更是層出不窮，極大地豐富和完善了分子生物學技術［15］。PCR 基本原理類似DNA 的天然復制，特異性引物與靶序列互補，通過變性、復性、延伸多個重復循環，從而獲得大量靶序列產物。從早期單一基因擴增檢測單一病原體，發展到現在的同時多基因檢測多種病原體，滿足了多種病原體混合感染的診斷。對于感染性病原體的診斷，檢測方法主要有如下幾種。

3.1 多重PCR 技術多重PCR 技術利用多對引物，同時擴增多種病原體基因。如Mo等［16］檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型甲型流感病毒H1N1。向彩云等［17］檢測肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，肺炎支原體，肺炎衣原體。

3.2 依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）NASBA 從PCR技術基礎上發展而來，擴增速率和靈敏度超過PCR 的恒溫擴增技術。Demian 等［18］報道用于呼吸道合胞病毒兩個血清型的擴增，靈敏度高于間接熒光法和病毒培養。

3.3 環介導等溫擴增技術（LAMP）LAMP是一種簡單、快速、靈敏的基因擴增技術，適宜病原體的快速分子生物學診斷。Ito等［19］用于檢測甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒。劉毅等［20］用于檢測痰液結核分枝桿菌。

3.4 靶序列富集多重PCR 技術一次反應中對多種靶序列進行敏感而特異的擴增和檢測，適宜呼吸道病原體混合感染的快速診斷。王鑫磊等［21］報道檢測鮑曼不動桿菌等14種病原體。

3.5 基因芯片技術將多種靶序列基因固定在載體上，與標記的樣本核酸雜交，雜交信號經芯片閱讀儀處理而得出檢測結果，可一次快速檢測多種呼吸道病原體［21－22］。

綜上所述，病原體的檢測方法層出不窮，為臨床醫生準確、快速診斷提供了有效途徑，并且隨著醫學知識與技術的不斷發展，病原體的檢測方法也將隨之發展。在臨床工作中結合實際，采用最適宜的檢測方法可為結果的準確、快速提供必要的保證。

［1］Fishman AP，Elisa JA，Fishman SA，et al.Fishman′s Pulmonary Disease and Disorders［M］.4th ed.McGraw－Hill Company，2008：361－457.

［2］周先志.禽流感病［J］.臨床內科雜志，1999，16（4）：172－174.

［3］Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avianorign influenza（H7N9）virus［J］.N Engl J Med，2013，368（20）：1888－1897.

［4］黃平，俞守義.人類冠狀病毒與SARS－CoV［J］.中國預防醫學雜志，2005，6（6）：552－555.

［5］唐神結，高文.臨床結核病學［M］.北京：人民衛生出版社，2011：39－44.

［6］Dfaz A，Barria P，Niederman M，et al.Etiology of community－acquired pneumonia in hospitalized Patients in child：the increasing prevalence of respiratory viruses among classic pathogens［J］.Chest，2007，131（3）：779－787.

［7］Miyashita N，Shimizu H，Ouchi K，et al.Assessment ofuseful－Ness of sputum Gram stain and culture for diagnosis of Community－acquired pneumonia requiring hospitalization［J］.Med Sci Monit，2008，14（4）：171－176.

［8］陳輝蘭.直接免疫熒光法病毒抗原測定在呼吸道感染性疾病診斷中的應用［J］.中外醫學研究，2013，11（31）：53－54.

［9］俞小衛，王亞楠，程寶金，等.直接免疫熒光法病毒抗原測定在呼吸道感染性疾病診斷中的應用［J］.檢驗醫學，2013，28（1）：76－79.

［10］單詠梅，周宏，楊凡，等.呼吸道非典型病原體抗體實驗室檢測及病原分析［J］.國際檢驗醫學雜志，2013，34（17）：2297－2299.

［11］艾洪武，孫紅，陳莎，等.武漢地區冬春季兒童急性呼吸道感染病原學研究［J］.中華醫院感染學雜志，2012，22（5）：1075－1077.

［12］吉祖活，梁少君，魏慶，等.呼吸道病原體九聯檢試劑的應用價值［J］.檢驗醫學與臨床，2013，10（10）：1306－1306.

［13］楊侃，陳智，巫玉峰.蛋白芯片技術對1022例急性呼吸道感染的病原學檢測分析［J］.廣西醫學，2008，30（5）：628－630.

［14］邢穎，黃佳玲，程金華，等.蛋白芯片法對1076例急性呼吸道感染患兒的病原體檢測與分析［J］.中國現代醫學雜志，2011，21（22）：2752－2754.

［15］陳宇寧，劉冰，陳華根.目前檢驗醫學的發展趨勢和任務［J］.實用醫技雜志，2006，13（2）：302－303.

［16］Mo QH，Yang CL，Lin JC，et al.One－step multiplex RTPCR forrapid screening of type A，B and novel A（H1N1）influenza viruses［J］.J South Med Univ，2009，29（8）：1545－1547.

［17］向彩云，金海山，庹照林.多重PCR 檢測支氣管肺泡灌洗液中細菌性病原體的研究［J］.中國熱帶醫學，2011，11（7）：797－799.

［18］Deiman B，Schrover C，Moore C，et al.Rapid and highly sensitivequalitative real－time assay for detection of respiratory syncytial virus A and B using NASBA and molecular beacon technology［J］.J Virol Methods，2007，146（1／2）：29－35.

［19］Ito M，Watanabe M，Nakagawa N，et al.Rapid detection and typingof influenza A and B by loop－mediated isothermal amplication：comparison with immunochromatography and virus isolation［J］.J Virol Methods，2006，135（1）：272－275.

［20］劉毅，黃曙海，譚慧媚，等.環介導等溫擴增技術檢測肺結核患者痰標本中結核分枝桿菌［J］.臨床檢驗雜志，2012，30（1）：24－26.

［21］王鑫磊，姚靜怡，馬建新，等.液相芯片技術用于醫院獲得性呼吸道感染病原譜篩查［J］.臨床檢驗雜志，2010，28（4）：257－258.

［22］Cannon GA，Carra MJ，Yandlea Z，et al.A low density oligonucle－otide microarray for the detection of viral and atypical bacterial respiratory pathogens［J］.J Clin Virol，2010，163（1）：17－24.