靜水壓法人工誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體的探索＊

劉金相，王旭波，劉聰輝，高金寧，王忠凱，王文基，王志剛，于海洋，齊 潔，張全啟

（中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003）

鲆鰈是著名的海水經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受消費(fèi)者歡迎，是我國海水魚類養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)品之一。近年來，隨著鲆鰈的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，苗種需求量逐年增加。而國內(nèi)大部分養(yǎng)殖基地親本更換率過低，繁育群體過小，逐漸造成近交積累，導(dǎo)致鲆鰈養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性降低，主要表現(xiàn)為生長速度緩慢、對病害和惡劣環(huán)境的耐受能力下降等。雜交育種可以產(chǎn)生優(yōu)良性狀、增加變異性、豐富遺傳結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)新的遺傳特性。

魚類的雜交優(yōu)勢在國內(nèi)外已有很多成功的范例，Stevens等[1]用條紋鱸（Moronesaxatilis）和白鱸（Lateolabraxjaponicus）雜交，得到了生長快、抗逆強(qiáng)的雜交條紋鱸；徐慶登等[2]通過鯽（Carassiusauratus auratus）（♀）和白鯽（Carassiusauratuscuvieri）（♂）的雜交得到生長速度比母本快1～2倍的高郵雜交鯽。目前，海水魚類的雜交研究主要集中在鯛類和鲆鰈魚類。研究表明，平鯛（Rhabdosargussarba）（♀）和真鯛（Pagrosomusmajor）（♂）雜交[3]，黑鯛（Sparusmacrocephlus）和灰鰭鯛（Sparusberda）雜交[4]，均能得到生長優(yōu)勢明顯的 F1代。劉清華[5]通過對牙鲆（Paralichthysolivaceus）（♀）和夏鲆（Paralichthys dentatus）（♂）雜交，得到體重是牙鲆2倍的雜交鲆，并對其遺傳力進(jìn)行了估計(jì)；Wang等[6]用石鰈（Kareius bicoloratus）和牙鲆雜交，得到了生長優(yōu)勢和抗性明顯的F1代。關(guān)于鲆類和鰈類的雜交，Wang等[6]研究了牙鲆與石鰈科間雜交后代的早期發(fā)育和生長情況，證明鲆鰈魚類屬間甚至科間可以進(jìn)行雜交；李珺竹等[7]對牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交F1代的發(fā)育及遺傳學(xué)進(jìn)行了研究，證明牙鲆和圓斑星鰈雜交可以產(chǎn)生F1代。

隨著生長過程中性腺的發(fā)育和成熟，鲆鰈魚類腹部的隆起影響了其外觀，從而降低了其商品價(jià)值[8]。更為重要的是，在性腺發(fā)育成熟的過程中會(huì)消耗掉大量的能量，延緩甚至阻礙了個(gè)體的生長。因此，研究鲆鰈魚類的不育性對于提高其商品價(jià)值和養(yǎng)殖利益具有重要意義。魚類的三倍體因其染色體組的不平衡性，通常無法產(chǎn)生正常的生殖細(xì)胞，因此具有不育性或低育性[9]。由于其生長快、易于飼養(yǎng)、且不會(huì)干擾魚類資源等特點(diǎn)，三倍體魚已成為國內(nèi)外水產(chǎn)科學(xué)研究者的研究熱點(diǎn)。將雜交和多倍體2種選育手段相結(jié)合，理論上不僅可以使雜交子代綜合雙親的優(yōu)良性狀、增加變異性，獲得雜交優(yōu)勢，還能得到多倍體的生長速度快和不育等特性，從而獲得抗逆性高、生長速度快和不育的優(yōu)良品種。早在1943年，Makino等[10]就開始了人工誘導(dǎo)鯉（Cyprinuscarpio）三倍體的研究，之后Swarup[11]成功誘導(dǎo)了三刺魚（Gasterosteusaculeatus）的三倍體。自1980年代，三倍體誘導(dǎo)技術(shù)出現(xiàn)了長足進(jìn)展。在海水魚類方面，國內(nèi)外已經(jīng)先后在鮭鱒類[12]、鲆鰈 類[13]、真鯛[14]、黑鯛[15]和大黃魚（Pseudosciaena crocea）[16]等魚類中成功誘導(dǎo)出三倍體，并對F1代胚胎發(fā)育過程、染色體核型鑒定等進(jìn)行了初步研究。關(guān)于雜交三倍體的誘導(dǎo)研究，Purdom[17]誘導(dǎo)歐鰈（Pleuronectesplatessa）（♀）和 川 鰈（Platichthysflesus）（♂）的雜交三倍體獲得成功，并養(yǎng)成成魚；三倍體湘云鯽除不育的特點(diǎn)外，還具有生長快（比普通鯽魚生長速度快2～3倍）、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)、易捕撈、易垂釣等優(yōu)點(diǎn)[18]。在海水魚類方面，蔡明夷等[19]通過冷休克法誘導(dǎo)出大黃魚和黃姑魚（Nibeaalbiflora）的雜交三倍體，但尚沒有大量培育異源三倍體養(yǎng)殖群體的報(bào)道。

本研究通過靜水壓法誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體，篩選最佳的誘導(dǎo)條件，旨在為鲆鰈類異源多倍體的培育和生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的雌性牙鲆和雄性圓斑星鰈親魚來自山東省煙臺(tái)市黃海水產(chǎn)有限公司，親魚產(chǎn)卵前2個(gè)月進(jìn)行控溫控光，牙鲆和圓斑星鰈親魚分開養(yǎng)殖，養(yǎng)殖溫度為14～16℃，遮光率為70%～90%，并用優(yōu)質(zhì)餌料喂養(yǎng)。挑選體色和形態(tài)正常、體格健壯、性腺發(fā)育良好的親魚，人工擠壓親魚腹部，收集成熟的牙鲆卵和圓斑星鰈精子，用干法受精得到受精卵，受精卵培育在（15.0±0.2）℃鹽度30的海水中。

1.2 靜水壓誘導(dǎo)

為獲得最佳的雜交三倍體的靜水壓誘導(dǎo)條件，參考林琪[16]、許建和[20]和戈文龍[21]等人的研究數(shù)據(jù)，用水壓機(jī)（Biopress YB－5610，日本）對受精率進(jìn)行處理，對受精后的處理起始時(shí)刻（Timing after fertilization，TA）、加壓時(shí)間（Duration，D）和壓強(qiáng)強(qiáng)度（Pressure，P）進(jìn)行篩選。

對雜交三倍體誘導(dǎo)處理起始時(shí)刻（TA）的篩選，參考戈文龍[21]牙鲆減數(shù)分裂雌核發(fā)育技術(shù)，在溫度為（15.0±0.2）℃條件下，受精后3min進(jìn)行靜水壓處理為最佳處理時(shí)刻。

對壓強(qiáng)強(qiáng)度（P）進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)，設(shè)置壓強(qiáng)為55、60、65、70、75、80和85MPa，共7個(gè)梯度處理受精卵。處理溫度為（15.0±0.2）℃，處理時(shí)刻為受精后3min，根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)，設(shè)定加壓持續(xù)時(shí)間為6min，對照組取未經(jīng)處理的同批次的受精卵，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

加壓持續(xù)時(shí)間（D）的篩選設(shè)置2、4、6、8和10min，共5個(gè)處理梯度，處理壓強(qiáng)為70MPa，在篩選出的適宜壓強(qiáng)條件下處理受精卵，處理溫度為（15.0±0.2）℃，處理時(shí)刻為受精后3min。對照組取同批次的受精卵，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 相對孵化率的計(jì)算

各實(shí)驗(yàn)組和對照組在加壓處理2h后，取上浮的受精卵1 000粒在（15.0±0.2）℃鹽度30的海水中孵化，及時(shí)去除下沉的受精卵，觀察各發(fā)育時(shí)期并記錄存活胚胎的數(shù)目。胚胎孵化完成后，計(jì)算孵化率，將各實(shí)驗(yàn)組的孵化率除以對照組的孵化率，得出各實(shí)驗(yàn)組的相對孵化率。

1.4 三倍體率的計(jì)算

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取50尾孵化7d后的仔魚，利用Ploidy Analyser PA－Ⅰ（Partec，德國）倍性分析儀檢測DNA的相對含量，計(jì)算出每組的三倍體率。將每仔魚苗放入1個(gè)1.5mL的離心管中，用蒸餾水洗滌，隨后向離心管中加入0.2mL的PBS，將魚苗研磨成單個(gè)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸濁液，研磨完畢后，向每個(gè)離心管中加入2mL PARTEC染色劑，充分染色后，通過濾膜過濾，濾液裝入倍性分析儀配套的5mL試管中，將單細(xì)胞懸濁液混合均勻，將試管置于倍性分析儀中檢測樣品的DNA相對含量[22]。用正常雜交未處理的胚胎作為對照組。

1.5 染色體制備

隨機(jī)選取在最佳誘導(dǎo)條件下處理的脫膜孵化期胚胎100枚，對胚胎進(jìn)行秋水仙素處理，0.075mol/L的KCl進(jìn)行低滲處理，用卡諾試劑（乙醇與冰醋酸體積比3∶1）固定，用50%醋酸作為解離液將材料研磨成單細(xì)胞后滴片，滴片后在55℃下干燥，干燥后用Giemsa染色，在顯微鏡下觀察染色體和計(jì)數(shù)[23]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)各組誘導(dǎo)魚苗的相對孵化率和三倍體率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行單因素方差分析（One－Way ANOVA），用Games－Howell對各誘導(dǎo)組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行多種比較。

2 結(jié)果

2.1 靜水壓壓強(qiáng)的確定

靜水壓法人工誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體不同壓強(qiáng)處理的結(jié)果見表1。從表中可以看出，在海水溫度為（15.0±0.2）℃，處理起始時(shí)刻為受精后3min，處理持續(xù)時(shí)間6～8min條件下，各實(shí)驗(yàn)組的相對孵化率隨著壓力強(qiáng)度的增加而下降，當(dāng)壓力達(dá)到85 MPa時(shí)，受精卵全部死亡；在實(shí)驗(yàn)壓力強(qiáng)度范圍內(nèi)，三倍體的誘導(dǎo)率會(huì)隨著壓力強(qiáng)度的增加而升高。60MPa組和65MPa之間相對孵化率不存在顯著差異（P＞0.05），但三倍體率之間存在顯著差異（P＜0.05）；65 MPa組和70MPa組之間相對孵化率和三倍體率之間不存在顯著差異（P＞0.05）；70MPa組和75MPa組之間相對孵化率存在顯著差異（P＜0.05），但三倍體率之間不存在顯著差異（P＞0.05）。綜合以上分析，在靜水壓壓力為65和70MPa時(shí)誘導(dǎo)效果最佳，這2個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著差異；但70MPa三倍體率高于65 MPa組，因此，在實(shí)驗(yàn)條件下，為得到較高的三倍體率，應(yīng)選擇70MPa的壓力最佳。

表1 不同壓力強(qiáng)度下的相對孵化率和三倍體誘導(dǎo)率Table 1 Relative hatching rates and triploidy rates under different pressures

2.2 加壓時(shí)間的確定

靜水壓法人工誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體不同加壓時(shí)間的誘導(dǎo)結(jié)果見表2。從表中可以看出實(shí)驗(yàn)組的三倍體率在壓力承受范圍內(nèi)與加壓時(shí)間成正比，相對孵化率與加壓時(shí)間成反比，在加壓時(shí)間持續(xù)10min后，胚胎全部死亡。4min組和6min組相比，相對孵化率和三倍體率之間都存在顯著差異（P＜0.05），6min組和8min組相比，8min組的相對孵化率顯著低于6min組（P＜0.05），8min組三倍體率略高于6min組，但兩者之間不存在顯著差異（P＞0.05），綜合三倍體率和相對孵化率2個(gè)因素，最佳加壓時(shí)間為6min。

2.3 倍性鑒定

2.3.1 DNA的相對含量 采用倍性分析儀檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組仔魚的DNA相對含量，設(shè)置對照組DNA的相對含量為100（見圖1a）。經(jīng)檢測，實(shí)驗(yàn)組中三倍體雜交種DNA的相對含量在150左右（見圖1b），而未誘導(dǎo)成功的二倍體雜交種DNA的相對含量與對照組一致。

表2 不同加壓時(shí)間的相對孵化率和三倍體誘導(dǎo)率Table 2 Relative hatching rates and triploidy rates in various experimental groups by different duration of pressure shock

圖1 對照組二倍體（a）和實(shí)驗(yàn)組三倍體（b）相對DNA含量Fig.1 Relative DNA content of control group diploid（a）and experimental triploid（b）by ploidy analyzer

2.3.2 胚胎發(fā)育與染色體觀察結(jié)果 在海水溫度為（15.0±0.2）℃時(shí)，采用優(yōu)化的最佳誘導(dǎo)條件：受精后3min起，以70MPa壓力處理6min，大部分胚胎在早期發(fā)育正常，24.06%的胚胎能夠孵化出正常仔魚（見圖2）。受精后2h后，出現(xiàn)第一次卵裂進(jìn)入二細(xì)胞期，2.5h后進(jìn)入四細(xì)胞期，3h后進(jìn)入八細(xì)胞期；受精后12h，胚盤突出卵黃，進(jìn)入囊胚期；受精后16h后，胚盤下包，進(jìn)入原腸早期，28h后進(jìn)入原腸晚期，胚體開始形成；受精后36h，胚胎中部形成多個(gè)體節(jié)，并出現(xiàn)克氏泡，進(jìn)入體節(jié)期；受精后72h，胚體破殼而出，發(fā)育成初孵仔魚。

從該實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取的100枚胚胎經(jīng)染色體處理和制片觀察，有77枚胚胎可以看到染色體分裂相。其中染色體數(shù)目為47條的有49枚胚胎，占總數(shù)的63.63%（見圖3a），已由的報(bào)道顯示，牙鲆二倍體染色體為2n＝48，而圓斑星鰈二倍體染色體位2n＝46，其雜交后代的染色體數(shù)為2n＝47[10]，因此，這些胚胎應(yīng)該是牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）的雜交二倍體；25枚胚胎的染色體數(shù)目為71條左右（見圖3b），占總數(shù)的32.47%，即本實(shí)驗(yàn)所要誘導(dǎo)的雜交三倍體；此外，有3枚胚胎的染色體數(shù)目僅為24條（見圖3c），可能是未能受精的牙鲆的單倍體，占總數(shù)的3.9%。

圖2 牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交的胚胎發(fā)育Fig.2 Embryonic development of P.olivaceus×V.variegatus

圖3 牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交后代的染色體中期分裂相Fig.3 Metaphase spread from offspring of P.olivaceus×V.variegatus

3 討論

3.1 異源三倍體的誘導(dǎo)方法和誘導(dǎo)條件

目前用于人工誘導(dǎo)三倍體的主要方法有化學(xué)方法、生物學(xué)方法和物理方法等。化學(xué)方法是用化學(xué)藥物處理受精卵，干擾細(xì)胞的分裂，主要用的化學(xué)試劑有聚乙二醇、細(xì)胞松弛素、6－二甲基氨基嘌呤等[24]。生物學(xué)方法主要有遠(yuǎn)緣雜交、細(xì)胞融合和核移植等。目前遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生多倍體的具體機(jī)理還不清楚，細(xì)胞融合容易得到染色體數(shù)目并存的嵌合體魚，而核移植技術(shù)還需要進(jìn)一步的發(fā)展和完善。與上述2種方法相比，物理方法在誘導(dǎo)三倍體的研究中使用得更加普遍。靜水壓法是一種常用的物理方法，具有處理時(shí)間較短、誘導(dǎo)率較高、壓力傳導(dǎo)均勻、誘導(dǎo)過程中對受精卵的損傷較小等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于冷水性和暖水性魚類的誘導(dǎo)。該方法的原理是通過高強(qiáng)度的壓力使受精卵內(nèi)原有的微管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞紡錘絲的形成，暫時(shí)阻斷減數(shù)分裂的過程，抑制受精卵第二極體的排出，從而使染色體加倍。靜水壓誘導(dǎo)法已經(jīng)在斑馬魚雌核發(fā)育[25]、水晶彩鯽（Carassiusauratustransparentcoloredvar.）三倍體和四倍體[26]、虹鱒（Sahnomykiss）四倍體[27]、大黃魚三倍體[16]、黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）多倍體[28]和牙鲆雌核發(fā)育[21]等的誘導(dǎo)中，被證實(shí)要優(yōu)于熱休克法和冷休克法等物理方法。本研究誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體的成功，也再次證明靜水壓法是一種非常方便實(shí)用的多倍體誘導(dǎo)方法。

使用靜水壓法人工誘導(dǎo)魚類三倍體，其誘導(dǎo)效果主要受處理時(shí)刻、處理壓強(qiáng)和壓力持續(xù)時(shí)間3個(gè)因素的影響。由于處理的研究對象相同，都是抑制牙鲆卵的第二極體釋放，且處理溫度一致，因此本研究的受精后處理時(shí)刻（TA）直接采用了牙鲆三倍體的最佳誘導(dǎo)條件（TA：3min，P：60～70MPa，D：6min）[14]。而處理壓強(qiáng)稍有不同，則可能是由于異源精子誘導(dǎo)或是不同群體的魚卵之間存在一定的差異造成的。但是，與其它海水魚三倍體誘導(dǎo)的最佳條件相比，這一壓力強(qiáng)度和處理時(shí)間明顯高于或長于許多海水魚三倍體誘導(dǎo)的壓力強(qiáng)度和處理時(shí)間（大黃魚P：45MPa，D：3min，TA：3min；舌 鰨 P：36MPa，D：4min，TA：5 min）[16，29]，這可能是由于不同魚類的受精卵對壓力刺激的敏感性不一樣，從而造成了耐受壓力的不同。

3.2 三倍體的誘導(dǎo)效果

不同魚類雜交三倍體的誘導(dǎo)率之間差異較大。余波[30]對 虹 鱒 （Oncorhynchusmykiss）和美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinusfontinalis）雜交三倍體的誘導(dǎo)率為93.3%，蔡明夷等[19]對大黃魚和黃姑魚雜交三倍體的誘導(dǎo)率達(dá)到100%，而本次實(shí)驗(yàn)最佳條件的誘導(dǎo)率為（26.67±6.67）%。不同的誘導(dǎo)效果可能與不同的誘導(dǎo)方法、物種之間的敏感程度或倍性的檢測方法有關(guān)，也可能受種群地理分布的影響。本次研究在最佳誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)率相對較低，可能與卵子的質(zhì)量也有較大關(guān)系。由于實(shí)驗(yàn)所用卵子是通過人工擠卵獲得，魚卵的成熟程度和成熟的均一性可能難以保證，在受精后極體的排出時(shí)間會(huì)存在差異，導(dǎo)致誘導(dǎo)效果不同。

本研究在實(shí)驗(yàn)組的染色體制片觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)了3枚單倍體胚胎，但在DNA含量分析以及對照組中卻沒有發(fā)現(xiàn)單倍體。究其原因可能是因?yàn)樵贒NA含量分析時(shí)用的是初孵仔魚，染色體制片時(shí)用的是胚胎，在發(fā)育過程中單倍體胚胎會(huì)因?yàn)椤皢伪扼w綜合征”死亡。遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生單倍體的原因，一方面可能是異源精子在受精過程中，種間生殖細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生不親和現(xiàn)象，導(dǎo)致牙鲆卵未受精，發(fā)生雌核發(fā)育。遠(yuǎn)緣雜交過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育或雄核發(fā)育的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，Stanley[31]在以色列鏡鯉（C.carpio）（♀）和草魚（Ctenopharyngodon idella）（♂）的雜交后代中發(fā)現(xiàn)少數(shù)雄核發(fā)育個(gè)體；桂建芳等[32]在鯉（C.carpio）（♀）和鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）（♂）的雜交組合中，發(fā)現(xiàn)既有雌核發(fā)育的單倍體也有雄核發(fā)育的單倍體；劉穎[33]通過對大黃魚和黃姑魚的正反交實(shí)驗(yàn)，對存活的17尾幼魚進(jìn)行AFLP分析，也發(fā)現(xiàn)其中1尾幼魚是由大黃魚雌核發(fā)育的單倍體。

比例較高的單倍體胚胎存在，說明牙鲆卵子和圓斑星鰈精子之間受精還存在一定障礙，牙鲆與石鰈間[6]、牙鲆與圓斑星鰈間[7]間雜交雖然具有較高的受精率和孵化率，但畢竟這些種屬于不同的科，魚類不同科間的遠(yuǎn)緣雜交雖有一些報(bào)道，如奧利亞羅非魚（Oreochromisaurea）（♀）×鱖（Sinipercachuatsi）（♂）[34]，但成功者較少，雜交不親和現(xiàn)象表現(xiàn)突出。這種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種之間的受精困難，可能表現(xiàn)在在精子識(shí)別、精子進(jìn)入、原核形成以及原核融合等多個(gè)環(huán)節(jié)與親本各自種內(nèi)受精有所區(qū)別，繼而造成受精卵減數(shù)分裂和早期發(fā)育速度等發(fā)生變化，這也可能是造成本次誘導(dǎo)成功率較低的原因。因此，要想獲得牙鲆×圓斑星鰈異源三倍體更高的誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)條件可能尚需進(jìn)一步優(yōu)化。

4 結(jié)語

本研究通過靜水壓法篩選出誘導(dǎo)牙鲆（♀）×圓斑星鰈（♂）雜交三倍體的最佳條件，在溫度為（15.0±0.2）℃下，TA：3min，P：70MPa，D：6min。在最佳條件下的誘導(dǎo)率為（26.67±6.67）%。

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