身痛逐瘀湯對人髓核細胞模型PI3K/Akt信號通路Bad、Caspase-9、GSK-3β表達的影響

陳江　劉志超　張帆　孫旗　袁巧妹　祝永剛　輝燈　郭菲宇　柳根哲

摘要：目的 ?觀察身痛逐瘀湯對人髓核細胞模型PI3K/Akt信號通路凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β表達的影響，探討其可能的作用機制。方法 ?將人髓核細胞分為6組，分離培養、鑒定及傳代后，取第3代細胞進行實驗。人髓核細胞加入身痛逐瘀湯藥物血清，置于醫用恒溫靜水壓壓力罐中干預，分別于0.3、1、3 MPa壓力下作用2、4、6 h，應用倒置相差顯微鏡觀察人髓核細胞加壓前后形態及生長狀況，應用透射電子顯微鏡觀察人髓核細胞超微結構，流式細胞術檢測人髓核細胞凋亡，采用凝膠電泳遷移法檢驗人髓核細胞PI3K/Akt信號通路標志蛋白p-Akt的表達，Western blot檢測人髓核細胞Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表達。結果 ?同一壓力下及作用時間，中藥組人髓核細胞形態、超微結構和生長狀況較壓力組明顯變好，其中0.3、1 MPa壓力差異顯著（P<0.05）;與中藥組比較，壓力組人髓核細胞凋亡率顯著增加（P<0.05）;凝膠電泳遷移顯示，人髓核細胞在0.3、1、3 MPa壓力下中藥組p-Akt表達明顯高于壓力組（P<0.05）;Western blot結果顯示，中藥組人髓核細胞Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白表達較壓力組明顯降低（P<0.05）。結論 ?身痛逐瘀湯能有效延緩髓核細胞退變，增加細胞活性及減少細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/Akt通路抑制Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表達相關。

關鍵詞：身痛逐瘀湯;PI3K/Akt通路;靜水壓;髓核細胞;細胞凋亡

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0048-07

Effects of Shentong Zhuyu?Decoction on PI3K/Akt?Pathway?Bad， Caspase-9， GSK-3β?Expression?of Human Nucleus Pulposus Cells

CHEN Jiang¹， LIU Zhichao²， ZHANG Fan¹， SUN Qi¹， YUAN Qiaomei¹， ZHU?Yonggang²，XIAO Huideng²， GUO Feiyu²， LIU Genzhe²

1. Dongzhimen?Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China; 2.?Beijing?Traditional Chinese Medicine Hospital， Capital Medical University， Beijing 100010， China

Abstract： Objective?To investigate the effects of Shentong Zhuyu Decoction on the exprossion of Bad， Caspase-9， and GSK-3β in nucleus pulposus cells through PI3K/Akt?signal pathway and its possible mechanism. Methods?Human nucleus pulposus cells were divided into 10 groups. After isolation， culture， identification and passage of six?groups of nucleus pulposus cells， the third-generation cells （P3） were taken for experiment. The human nucleus pulposus cells were added into the serum containing Shentong Zhuyu?Decoction and intervened in a medical hydrostatic pressure vessel with constant temperature. After 2， 4 and 6 hours of action under 0.3， 1，?3 MPa pressure， inverted phase contrast microscopy was used to observe the morphological changes and growth status of nucleus pulposus cells before and after compression. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructural changes and differences of nucleus pulposus cells in each group. Annexin V-FITC/Propidium Iodide flow cytometry was used to detect apoptotic status of nucleus pulposus cells in each group. Electrophoreticmobility shift assay was used to test the activity of p-Akt in PI3K/Akt pathway of the nucleus pulposus cells of each group， and the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β in nucleus pulposus cells were detected by Western blot. Results?The morphology， ultrastructure and growth of nucleus pulposus cells in TCM group were better than those in the pressure group under the same pressure and time， and the difference was significant under 0.3 MPa and 1 MPa （P<0.05）. Compared with TCM group， the apoptotic rate of nucleus pulposus cells in the pressure group increased significantly （P<0.05）. Electrophoretic mobility shift assay?showed thhat the expression of p-Akt?in TCM group was significantly higher than that in the pressure group under 0.3， 1，?3 MPa pressure （P<0.05）. Western blot showed that the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β in TCM group decreased as a whole， which was significantly different from that in the pressure group （P<0.05）. Conclusion?Shentong Zhuyu?Decoction can effectively delay the degeneration of nucleus pulposus cells， increase cell activity and reduce cell apoptosis. Its mechanism may be related to activating PI3K/Akt signal pathway to inhibit the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β.

Keywords：Shentong ZhuyuDecoction; PI3K/Akt pathway; hydrostatic pressure; nucleus pulposus cells; apoptosis

椎間盤退行性疾病（intervertebral disc degeneration?disease，IVDD）是最多見的骨科疾病，據報道70%～90%人均患過腰痛，年發病率為10%～30%，且呈逐年上升趨勢^[1]。流行病學調查顯示，IVDD發病人群越來越趨于年輕化，追蹤病史分析病因，發現久坐、久站等原因已經逐漸成為主要的致病因素，提示人體脊柱長期受到的靜壓負荷是引發IVDD的重要因素^[2]。椎間盤（intervertebral disc，IVD）在人體運動時受到壓應力在髓核中形成靜水壓，然后擴散至纖維環，由壓應力轉變成張應力，因此IVDD與人髓核細胞活力和凋亡密切相關。臨床上身痛逐瘀湯治療IVDD療效甚佳，因此，本實驗在體外靜水壓加載系統中，以人椎間盤髓核細胞為研究對象，以常壓環境為對照，根據前期研究結果設計3種水平的細胞靜水壓加載負荷（0.3、1、3 MPa），采用身痛逐瘀湯藥物血清對髓核細胞培養狀態進行干預，檢測PI3K/Akt信號通路及其凋亡蛋白的表達，揭示身痛逐瘀湯治療IVDD的療效機制及作用靶點。

1 ?實驗材料

1.1 ?動物

5月齡健康新西蘭兔10只，體質量2～4 kg，雌雄不限，中國中醫科學院實驗動物中心提供。飼養于中國中醫科學院基礎理論研究所動物房，溫度24～26 ℃，相對濕度45%～65%，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物及制備

身痛逐瘀湯（秦艽3 g，川芎6 g，桃仁9 g，紅花9 g，甘草6 g，羌活3 g，沒藥6 g，當歸9 g，香附3 g，牛膝9 g，川烏3 g，地龍6 g），飲片由北京中醫藥大學東直門醫院中藥房提供。藥物血清制備：將飲片裝入容量1 L的圓底燒瓶中，加20倍水，浸泡4 h，放入套式恒溫器煎煮，煮沸1.5 h后，藥液紗布過濾，4000×g離心10 min，將上層藥液置于濾紙過濾，完畢后倒入500 mL圓底燒瓶中，裝入旋轉蒸發儀進行蒸發（73 ℃，轉速4×g），最后濃縮至20～30 mL，將浸膏倒入培養皿中，放入真空干燥箱（50 ℃）真空干燥2 d，收取固體浸膏，稱重，最終藥液濃度為0.25 g/mL（7.81 g原藥材/mL）。

1.3 ?主要試劑與儀器

DMEM/F12培養基（GIBCO），胰酶/EDTA（美國Sciencell公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶公司），丙烯酰胺（VETEC），彩虹180光譜蛋白Maker（北京索萊寶公司），Anti-Caspase 9抗體（欣博盛生物科技有限公司），Anti-GSK-3β抗體（賽信通生物試劑有限公司），Anti-Bad抗體（Abcam），Anti-GAPDH抗體（Abcam），雙抗P/S Solution（美國Sciencell公司）。倒置相差顯微鏡（奧林巴斯，IX50），透射電鏡（Hitachi，HF5000），流式細胞儀（美國Beckmam，型號Cytomics FC500），發光凝膠成像系統（英國SYNGENE，型號GeneGnome XRQ），蛋白電泳儀（美國Bio-rad，PowerPac^TM），全自動酶標儀（美BioTek，型號Synergy H1），醫用恒溫靜水壓壓力罐（北京世紀森朗實驗儀器有限公司）。

2 ?實驗方法

2.1 ?造模

人髓核細胞由Sciencell Research Laboratories提供。復蘇細胞時先將髓核細胞從液氮中取出，立即放入37 ℃恒溫水浴中，待完全融化后取出，使用移液器將髓核細胞重懸后1000 r/min離心5 min，棄上清液后傳代培養髓核細胞，鏡下見髓核細胞增殖到約90%瓶底時傳代，獲得第3代髓核細胞（P3）后，將髓核細胞放入醫用恒溫靜水壓壓力罐中進行造模，壓力設定為0.3、1、3 MPa，分別作用2、4、6 h。

2.2 ?分組

實驗分為單純壓力干預組（壓力組）、壓力+藥物血清組（中藥組）共6組，分別為0.3、1、3 MPa壓力環境/單純DMEM培養組，0.3、1、3 MPa壓力環境/DMEM+藥物血清組。

2.3 ?給藥

按“兔表面積/人體表面積=兔的給藥量/人給藥量”的換算方法，計算兔給藥劑量為3.50 g（/kg·d），為保證血清含藥量，盡量調高給藥劑量，最終給藥劑量為28 g/（kg·d），即原給藥劑量的8倍。中藥組2只兔分別為3.2、3.8 kg/只，藥物180 g溶于130 mL純水中，以20 mL/（kg·d）灌胃，連續3 d，最后1 d灌胃結束1 h后，耳緣靜脈取血，每只家兔取血約50～60 mL，4 ℃靜置數小時后，3500 r/min離心15 min，取血清，56 ℃滅活30 min，過濾分裝，-80 ℃冰箱保存。課題組前期研究利用MTT比色法篩選出身痛逐瘀湯藥物血清最佳給藥濃度為15%，藥物干預時間為24 h，因此選用15%身痛逐瘀湯藥物血清濃度。

2.4 ?人髓核細胞模型一般形態觀察

3代髓核細胞鋪片連同培養基一起裝入10 mL注射器中，在靜水壓加載裝置中通過注入氮氣加壓，靜水壓設定為0.3、1、3 MPa，以模擬人體不同體位下椎間壓力環境，每個靜水壓分別作用2、4、6 h，并通過智能溫控裝置使容器內溫保持在37 ℃。造模結束后，將氣體放掉，打開裝置蓋子，取出注射器，PBS沖洗玻片3遍，4%多聚甲醛固定30 min，利用倒置顯微鏡觀察細胞成長及其形態變化。

2.5 ?人髓核細胞模型超微結構觀察

分別制作壓力組和中藥組髓核細胞電鏡樣本，觀察靜水壓加壓前后髓核細胞的超微結構。分別為0.3、1、3 MPa，以模擬人體不同體位下椎間壓力環境，每個靜水壓分別作用2、4、6 h。取出細胞玻片，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。

2.6 ?流式細胞術檢測人髓核細胞凋亡

人髓核細胞2000 r/min離心5 min，胰酶消化，收集1×10⁵～5×10⁵細胞，添加500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻后，加5 μL Propidium Iodide，混勻室溫、避光、反應5～15 min，1 h內流式細胞儀檢測。正常活細胞不被Annexin V- FITC和Propidium Iodide染色;凋亡早期細胞僅被AnnexinV-FITC染色，Propidium Iodide染色呈陰性;壞死細胞和凋亡晚期細胞同時被AnnexinV-FITC和Propidium Iodide染色。

2.7 ?凝膠電泳遷移法檢測p-Akt活性

使用核蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白，按產品說明書進行p-Akt探針標記，采取10 V/cm電壓電泳10 min，干燥，X光片壓片，檢測各組灰度值。

2.8 ?Western blot檢測Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表達

①組織蛋白提取：將收集的細胞樣本離心，加入RIPA裂解液（含PMSF），離心10 min后，抽吸上清液，-80 ℃冰箱保存。②蛋白含量測定：將標準品及樣本PBS稀釋后，加入工作液，37 ℃反應30 min，于酶標儀檢測OD值并畫出標準曲線，計算樣本蛋白濃度。③電泳：將分離膠灌入玻璃板間，加入無水乙醇封層后倒出乙醇，然后將濃縮膠倒入分離膠上層，即刻插入梳子，37 ℃等待40 min，取下玻璃板后放入電泳槽，100 V電泳，當樣品到濃縮膠與分離膠交界時，改為200 V電泳至終止。④轉膜：卸膠、剪膠，放入緩沖液中15 min;剪下PVDF膜，分別浸潤在甲醇、超純水、電轉液中;平鋪濾紙、PVDF膜、凝膠及濾紙，構成“三明治”模型，固定放入半干轉儀器中，25 V恒壓轉膜30 min。⑤孵育及顯影：轉膜后，將膜置于一抗溶液，室溫水平搖動1 h，4 ℃孵育過夜;次日TBST洗膜10 min×3次，二抗（1︰3000）室溫孵育60 min，TBST沖洗10 min×3次。膜上滴加ECL反應液500 μL，30 s后，曝光10 min，成像。

3 ?統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。研究所得指標均獨立重復測定3次，實驗數據以x（—）±s表示，2組間比較符合正態分布采用獨立t檢驗，2組間比較不符合正態分布用秩和檢驗;多組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 ?結果

4.1 ?光鏡觀察結果

①細胞體積：0.3、1、3 MPa靜水壓作用4 h，人髓核細胞體積均縮小，3 MPa靜水壓作用下細胞體積縮小最明顯;②突起：0.3、1、3 MPa靜水壓作用下細胞突起均變短，3 MPa靜水壓作用下細胞突起縮短最明顯，部分細胞突起不顯著，呈皺縮狀改變;③相同壓力和加載時間，中藥組較壓力組人髓核細胞數目更多，形態保存更完整，生長狀況更好。結果見圖1。

4.2 ?電鏡觀察結果

人髓核細胞超微結構變化：①人髓核細胞在0.3、1、3 MPa靜水壓作用4 h后突起均有斷裂。②0.3、1 MPa靜水壓作用下人髓核細胞主級突起完整、次級突起均有斷裂;3 MPa靜水壓作用下人髓核細胞主級突起與次級突起均有斷裂。③相同靜水壓不同作用時間，人髓核細胞超結構無明顯變化。④相同壓力和作用時間，中藥組較壓力組人髓核細胞在掃描電鏡下形態及超微結構保存更完整，生長狀況更好。結果見圖2。

4.3 ?身痛逐瘀湯對人髓核細胞模型凋亡的影響

2組人髓核細胞0.3、1、3 MPa作用2 h細胞凋亡率較低。隨著時間的增加，壓力組和中藥組0.3、1、3 MPa細胞凋亡率上升，其中3 MPa靜水壓作用2、4、6 h細胞凋亡率較0.3 MPa差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;2組人髓核細胞3 MPa作用4 h細胞凋亡率明顯增加;中藥組人髓核細胞0.3 MPa作用2 h后凋亡率最低，壓力組人髓核細胞3 MPa壓力作用6 h凋亡率最高;2組人髓核細胞3 MPa壓力作用4 h和6 h，細胞凋亡率差異不明顯（P>0.05）。結果見圖3。

4.4 ?身痛逐瘀湯對人髓核細胞模型PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響

0.3 MPa壓力作用下隨著時間的增加，中藥組人髓核細胞p-Akt表達4 h時下降，6 h時明顯增加，壓力組人髓核細胞p-Akt表達呈上升趨勢，但中藥組p-Akt水平明顯高于壓力組，差異有統計學意義（P<0.05）;壓力組凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表達隨時間增加而升高，加入身痛逐瘀湯藥物血清后其表達受到抑制，其中4 h時最明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖4。

1 MPa壓力作用下，隨著時間的增加，壓力組人髓核細胞p-Akt表達4 h時明顯升高，6 h時降低，整體水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥組人髓核細胞p-Akt水平隨著時間的增加其表達逐漸降低，但中藥組p-Akt整體水平高于壓力組，差異有統計學意義（P<0.05）;壓力組人髓核細胞凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表達隨時間增加而升高，而加入身痛逐瘀湯藥物血清后其表達受到明顯抑制，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

3 MPa壓力作用下，隨著時間的增加，壓力組人髓核細胞p-Akt表達4 h時明顯升高，6 h時明顯降低，但整體水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥組人髓核細胞p-Akt表達2 h時最高，后隨著時間增加其表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表達隨時間增加而升高，加入身痛逐瘀湯藥物血清后其表達受到明顯抑制，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。

5 ?討論

PI3K/Akt通路在調控椎間盤髓核細胞凋亡方面發揮著重要作用。Deng等^[3]研究發現，淫羊藿苷通過PI3K/Akt途徑抑制大鼠髓核間盤細胞H₂O₂誘導的凋亡，其機制是淫羊藿苷顯著降低了H₂O₂誘導的細胞凋亡和細胞內活性氧，上調p-Akt和Bcl-2表達，下調Caspase-3和Bax表達。Liu等^[4]研究發現，椎間盤受到應力刺激時，髓核細胞可激活PI3K/Akt信號通路抑制促凋亡Bcl-2家族成員Bad、Caspase-9、GSK-3β等凋亡轉錄因子的轉錄而起到抑制髓核細胞凋亡的作用。

研究表明，當過高的壓力加載時，IVD會發生形變，且IVD內的靜水壓會明顯增加，導致IVD內水分外移，繼而細胞外基質分解加快，IVD內環境趨于惡化，誘發IVDD^[5-6]。反之IVD內靜水壓缺失同樣會導致IVD組織內蛋白聚糖的表達量顯著降低，這種作用與壓力的強度和作用時間相關^[7-8]。這些結果同國外學者的研究結果^[9-12]一致。表明靜水壓力學因素與IVD髓核細胞的凋亡和細胞外基質代謝的影響最為密切^[13-14]。

中醫學認為，腰痹常由氣血瘀滯引起，現代醫學提出腰腿痛的根本原因是炎性因子刺激或神經根受壓后水腫所致^[15]。北京中醫藥大學東直門醫院名老中醫孫呈祥教授總結治療臨床腰腿痛的核心是行氣活血，關鍵是祛瘀通絡，并以中醫經典方劑身痛逐瘀湯臨床辨證治療IVDD療效較好^[16]，方中秦艽、羌活祛風除濕，沒藥、香附行氣血、止疼痛，桃仁、紅花、當歸、川芎活血祛瘀，牛膝、地龍疏通經絡以利關節，甘草調和諸藥，全方共奏活血祛瘀、祛風除濕、通痹止痛之效。國內有關身痛逐瘀湯治療IVDD的相關臨床研究報道顯示該方療效顯著^[17-19]。

本研究以身痛逐瘀湯藥物血清在體外靜水壓環境下干預人椎間盤髓核細胞，表明中藥藥物血清對髓核細胞活力、形態和超微結構具有保護作用，降低髓核細胞凋亡率。Western blot檢測加入身痛逐瘀湯藥物血清后人髓核細胞p-Akt表達升高，凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β表達降低。通過與壓力組對比發現，隨著椎間盤靜水壓的增加身痛逐瘀湯藥物血清后雖不能逆轉間盤退變趨勢，但明顯抑制了這一進程，說明身痛逐瘀湯可能通過上調PI3K/Akt通路的表達延緩人髓核細胞凋亡，從而減緩椎間盤退變。

綜上所述，體外培養髓核細胞存在時間-壓力依賴關系，作用時間延長及壓力增大均可導致髓核退變;在相對短時間內（6 h內），壓力負荷是導致髓核細胞凋亡的主要因素，低靜水壓環境（0.3、1 MPa）下，髓核細胞活力隨時間變化不明顯，而在高靜水壓（3 MPa）環境下，隨時間增加，髓核細胞活力顯著下降;身痛逐瘀湯可能通過激活PI3K/Akt信號通路，進而調控通路相關分子蛋白的表達，延緩IVD的退變，其作用機制可能與抑制Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白表達相關。

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