益氣通絡法對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡和HO-1表達的影響

常 庚，孫大勇，常風云，孫曉培，韓 杰

（1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，大連 116011；2.河北醫(yī)科大學中西結合學院，石家莊 050091）

益氣通絡法對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡和HO-1表達的影響

常 庚1，孫大勇1，常風云2，孫曉培1，韓 杰1

（1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，大連 116011；2.河北醫(yī)科大學中西結合學院，石家莊 050091）

[目的]觀察益氣通絡法對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變（DPN）的療效，并探討其作用機制。[方法]Wistar大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素復制糖尿病模型，對成模大鼠每日用益氣通絡法灌胃，8周后檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目，乳酸脫氫酶（LDH）活性，促凋亡因子Bax、Caspase-3和血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達水平。[結果]與模型組比較，益氣通絡法明顯減少糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)凋亡細胞數(shù)目，降低LDH含量、抑制Bax、Caspase-3的表達，增加HO-1蛋白的表達。[結論]益氣通絡法能有效上調HO-1的表達，降低坐骨神經(jīng)細胞的凋亡，預防和治療糖尿病周圍神經(jīng)損傷。

糖尿病周圍神經(jīng)病變；凋亡；坐骨神經(jīng)

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率高達60%～90%，以感覺神經(jīng)受累最為常見，是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴重影響糖尿病患者的生存質量[1-3]。筆者采用經(jīng)驗方益氣通絡法治療該病取得較好的療效，本研究通過觀察益氣通絡法對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡及二相酶血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白的表達等，探究益氣通絡法治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機制，為其在臨床應用提供實驗依制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級Wistar雄性大鼠60只，體質量150～180 g，鼠齡4～6周，由河北省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2藥品及試劑 益氣通絡法組成：黃芪、桃仁、紅花、懷牛膝、赤芍、威靈仙、當歸等（購自樂仁堂藥房，經(jīng)河北醫(yī)科大學中藥系鑒定，符合國家藥典標準），在河北醫(yī)科大學中藥系指導下常規(guī)水煎，醇提，濃縮至含生藥3 g/mL備用。測定乳酶脫氫酶（LDH）的試劑購自南京建成生物工程研究所，HO-1蛋白一抗購自Cell Signal公司，鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司，Caspase一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，Bax購自Santa Cru公司；TNNUL細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.3模型建立及給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機抽取20只為對照組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進水。其余大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)（標準飼料67.5%，豬油10%，蛋黃2.5%，蔗糖20%）喂養(yǎng)，4周后禁食12 h，一次性腹腔注射1%的鏈脲佐菌素（50 mg/kg，檸檬酸鈉—檸檬酸緩沖液配制）造模，72 h后以空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有胰島素抵抗者為造模成功，正常對照組腹腔注射等體積枸椽酸緩沖液。將成模大鼠再隨機分為模型組19只、中藥干預組19只。

中藥干預組：每日給益氣通絡法中藥25 g/kg（相當于成人計量的20倍）。正常對照組、模型組：每日給相同容積的生理鹽水灌胃。中藥干預共8周。

1.4標本采集 中藥干預8周后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛完全麻醉后，剖取坐骨神經(jīng)，取部分組織固定于4%的甲醛溶液中。按常規(guī)固定、脫水，石蠟包埋，切片以供檢測細胞凋亡、Bax、Caspase-3、HO-1等備用。其余坐骨神經(jīng)組織制成勻漿，以供檢測LDH活性。

1.5TNNUL法檢測細胞凋亡率 應用TNNUL法檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡,操作步驟按說明書。

1.6Bax、Caspase-3表達的檢測 4%多聚甲醛固定40 min，Triton X-100浸透10 min，10%馬血清封閉60 min阻斷非特異性染色,單克隆抗體Bax、Caspase-3搖床過夜，次日加生物素化馬抗小鼠IgG 60 min，SABC 60 min，DAB顯色3～10 min，脫水、透明、封固。

1.7LDH活性檢測 采用比色法測定坐骨神經(jīng)組織勻漿中的LDH活性，測試操作過程嚴格按照說明書進行。

1.8HO-1蛋白表達的檢測 采用Western印跡方法測定。以每個樣品的總蛋白為200 μg進行上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF，脫脂奶粉封閉，一抗封閉4℃過夜，二抗37℃孵育1 h（羊抗兔），漂洗后用增強化學發(fā)光法檢測蛋白表達，自動掃描，進行灰度分析。

1.9統(tǒng)計分析 采用Excel軟件及SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)方差齊時，組間比較用方差分析；方差不齊時，采用秩和檢驗，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及坐骨神經(jīng)組織中LDH含量 與正常對照組比較，模型組在坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及坐骨神經(jīng)組織中LDH含量均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥干預組在坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及坐骨神經(jīng)組織中LDH含量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 中藥干預對坐骨神經(jīng)組織中LDH及凋亡數(shù)目的影響（±s）

表1 中藥干預對坐骨神經(jīng)組織中LDH及凋亡數(shù)目的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01。

組別 LDH（U/mg） 凋亡數(shù)目（個）正常對照組 167.2±63.4 6.25±0.50模型組 445.5±91.7 37.38±6.00中藥干預組 267.2±63.4* 19.34±3.75*

2.2凋亡因子Bax、Caspase-3表達的檢測 與正常對照組相比，模型組Bax、Caspase-3的表達均顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥干預組Bax、Caspase-3表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1、圖2。

圖1 Caspase-3在坐骨神經(jīng)表達

圖2 Bax在坐骨神經(jīng)的表達

2.3坐骨神經(jīng)HO-1蛋白的表達 檢測中藥干預對坐骨組織HO-1蛋白表達的影響，利用圖片掃描儀分析結果顯示：中藥干預組的坐骨神經(jīng)組織中HO-1蛋白的表達高于正常對照組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 中藥干預對坐骨神經(jīng)組織中HO-1表達的影響

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”的范疇，糖尿病周圍神經(jīng)損傷屬于糖尿病常見的慢性并發(fā)癥。依據(jù)中醫(yī)“久病入絡”和“久病多虛”的理論，認為其病機主要由于消渴日久正氣虧虛，不能行血，瘀阻絡脈所導致[4-5]。益氣通絡法有益氣養(yǎng)血，活血通絡之功能。

坐骨神經(jīng)細胞損傷和凋亡是糖尿病周圍神經(jīng)病變早期的病理、生理特征之一[5]。臨床病理證實，糖尿病患者坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目顯著增加，其典型的凋亡相關超微結構變化為核膜破裂以及形成凋亡小體等。本研究結果顯示，中藥干預組坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及LDH活性顯著下降。提示中藥方劑益氣通絡法可顯著改善周圍神經(jīng)病變（DNP）大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡，具有有效的神經(jīng)細胞保護作用。

細胞凋亡具有復雜的分子調控機制病變[6]。目前認為Caspase-3、Bax是促進凋亡的重要因子[7]。Caspase-3被認為是Caspase級聯(lián)反應中最關鍵的效應蛋白酶，是細胞凋亡過程中的終末剪切酶，該酶是否被激活也是鑒別細胞凋亡與壞死的主要依據(jù)；促凋亡蛋白Bax可改變線粒體膜的通透性，使線粒體膜間隙的細胞色素C（Cytochrome C）誘導細胞凋亡[8]。結果顯示，給予中藥方劑益氣通絡法干預后，坐骨神經(jīng)細胞凋亡率及Bax和Caspase-3表達下降。提示益氣通絡法可以有效降低促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的表達，抑制坐骨神經(jīng)細胞的凋亡。

氧化應激密切參與了糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生機制，在高血糖條件下，自由基生成增多是糖尿病臨床并發(fā)癥的首要原因[9-10]。組織中HO－1是哺乳動物組織細胞微粒體的一種蛋白酶，催化血紅素產(chǎn)生膽綠素、一氧化碳（CO）和鐵[11-12]。膽綠素再形成膽紅素，兩者是體內強有力的自由基清除劑。研究證實，氧化應激是導致細胞凋亡的重要機制，上調HO-1可以顯著抑制氧化應激誘導的細胞凋亡。研究顯示，益氣通絡法能明顯上調抗氧化蛋白HO-1的表達。

綜上所述，氧化應激和細胞凋亡在糖尿病周圍神經(jīng)病變中都起到了重要作用，并且兩者是相互聯(lián)系的。推測益氣通絡法治療糖尿病周圍神經(jīng)病是通過上調抗氧化蛋白HO-1表達，抑制凋亡因子，以減輕坐骨神經(jīng)細胞凋亡和損傷，延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生與發(fā)展。

[1]方朝暉，趙進東.從葉天士辛潤通絡法論治糖尿病周圍神經(jīng)病變[J].天津中醫(yī)藥，2013,30(7):410-411.

[2]馮天笑.活血通絡法治療糖尿病周圍神經(jīng)病變研究概況[J].天津中醫(yī)藥，2011，28（5）：438-440.

[3]張 玉，李云平.穴位注射治療糖尿病周圍神經(jīng)病變研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2011，28（4）：348-350.

[4] 高 岑，宋俊生，薛曉煥，等.當歸四逆湯與西藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效比較的系統(tǒng)評價[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2011，30（3）：155-159.

[5]張 月，王 凡.活血降糖膠囊治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2008，27（4）：278-279.

[6]李 超，伏圣博，劉華玲,等.細胞凋亡研究進展[J].世界科技研究進展，2007,29(3):45-53.

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Effects of Yiqi Tongluo formula on cell apoptosis and the expression of anti-Oxidant of HO-1 in sciatic nerve on diabetic peripheral neuropathy

CHANG Geng1,SUN Da-yong1,CHANG Feng-yun2,SUN Xiao-pei1,HAN Jie1
（1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China; 2.Hebei Medical University,Shijiazhuang 050091,China）

[Objective]To discuss the effects of Yiqi Tongluo formula on rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN)and explore its potential mechanisms.[Methods]The rat model of DPN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocinith,and DPN rats were divided into treatment group treated with daily Yiqi Tongluo formula for eight weeks.The expression of LDH,Bax,Caspase-3 and the number of cell apoptosis in the sciatic nerve were evaluated and compared.[Results]Compared with the model group,the number of apoptotic cells and the expression of LDH,Bax,Caspase-3 were lower in the Yiqi Tongluo group in rat sciatic nerve,while the expression of HO-1 is higher significantly.[Conclusion]Yiqi Tongluo formula can effectively increase the expression of HO-1,inhibit the oxidative damage and reduce cell apoptosis in sciatic nerve.

diabetic peripheral neuropathy;cell apoptosis;sciatic nerve

R285.5

：A

：1673－9043（2014）04－0216-03

2014-03-05）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.08

常 庚（1981-），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

韓 杰，E-mail:hjj.427@163.com。